适用范围

适用于人胚胎干细胞hESCs、人诱导多能干细胞hiPSCs的培养

试剂组成

人多能干细胞基础培养基（500ml，货号 RC200120 - A，存储于 2 - 8℃）

人多能干细胞添加剂（1ml X 5，货号 RC200120 -   B，存储于 - 20℃）

操作方法

1.  完全培养基配制：2 - 8℃解冻添加剂，融化后摇匀，瞬时离心、按 1% 比例加入基础培养基混匀，2 - 8℃可稳定储存  2 周，使用前室温复温至少 30 分钟，操作需无菌，开封前试剂表面用 75% 酒精擦拭。 

2. 基质胶包被：取出基质胶（Matrigel），按一定量加入到培养器皿中，轻轻晃动使基质胶完全覆盖培养器皿底部。然后将培养器皿置于37℃细胞培养箱中孵育1-2小时。

3.  细胞复苏：细胞复苏前准备好完全培养基，室温复温后置于超净工作台备用。从液氮中取出存储的多能干细胞（hESCs、hiPSCs），快速移入37℃水浴锅中融化，过程中轻柔晃动，至冻存管内剩余微小块冰即取出。75%酒精清洁后移入超净工作台。轻柔将细胞移入15 ml离心管，取5 ml完全培养基由慢到快加入离心管，轻轻混匀。220 g水平离心5分钟，弃去上清，加入完全培养基重新悬浮细胞。弃去已包被培养器皿中的型基质胶，将细胞接种于培养器皿中，使细胞均匀分布，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。接种时加入ROCK抑制剂（Y27632，10μM），第二天更换新鲜完全培养基，去除ROCK抑制剂。

4. 培养与换液：24小时后，倒置显微镜观察细胞。弃去培养上清，更换已复温的新鲜完全培养基。若有较多漂浮细胞，弃去培养上清后用半量新鲜新鲜培养基轻柔地清洗一次，然后加入新鲜完全培养基。将器皿放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱继续培养。每24小时换液一次。

5. 传代：细胞生长至80%汇合后进行传代。弃去培养上清，细胞用PBS洗2次，加入适量消化液，置于37℃培养箱中消化3-5分钟。每2分钟置于导致显微镜下观察，待克隆边缘发亮时即轻柔吸除消化液。加入适量的完全培养基轻柔吹打细胞数次，将细胞悬液移至离心管中，220 g离心5分钟。弃上清，轻轻振荡使细胞团块散开，加入适量的完全培养基重新悬浮细胞。按照合适的密度（传代比1:10 - 1:30）接种到已经包被好的培养器皿，使其均匀分布后放入培养箱继续培养。接种时加入ROCK抑制剂（Y27632，10μM），第二天更换新鲜完全培养基，去除ROCK抑制剂。

6. 冻存：细胞生长至80%汇合时进行细胞冻存。细胞收获方式同细胞传代。获取的细胞弃上清，轻轻振荡使细胞团块散开，加入适量的细胞冻存液，轻轻吹打3-5次混匀细胞，移入冻存管中，按照程序降温的方式进行冻存，液氮中长期保存。

7. 注：具体操作参考产品说明书和官方提供的技术资料。