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人多能干细胞完全培养基

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RC200120人多能干细胞完全培养基2380


产品信息

产品名称:人多能干细胞完全培养基

货号:RC200120

批号:见包装

试剂清单:

image.png

存储与有效期

组分12-8 ℃保存,组分2-20-80 ℃保存。所有组分均须避免反复冻融,各组分在所需要的温度下有效期为1年,配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存,稳定储存1-2周。

适用细胞:

适用于E8系统和mTeSR系统培养的人多能干细胞,包括人胚胎干细胞、人诱导多能干细胞。

产品介绍

人多能干细胞(human pluripotent stem cellshPSCs)包括人胚胎干细胞(hESCs)和诱导性多潜能干细胞(iPSCs)。多能干细胞培养的关键是维持细胞的多能性,避免细胞的分化。本产品无血清、成分明确,含有干细胞保护因子等,在保证细胞增殖的前提下可以有效防止细胞分化、凋亡。适用于Essential 8培养系统和mTeSR培养细胞的人多能干细胞培养,同时也适用于iPSCs建系。

操作方法

实验准备

u 完全培养基配制:

1.      添加物解冻:2-8℃解冻添加物(RC200120-B)。添加物融化后轻轻充分摇匀,分装或直接以20%的比例添加到基础培养基(RC200120-A)中。分装后添加物立即存储于-20-80 ℃,避免反复冻融。

注意:解冻添加物可于2-8℃冰箱过夜,切不可置于37℃水浴剧烈解冻,解冻后请务必充分混匀,以保证添加物的均匀度。

2.      完全培养基配制:将解冻的添加物(RC200120-B)以20%比例加入到基础培养基(RC200120-A)中,充分混匀,即配制成完全培养基。完全培养基在2-8℃可稳定储存1-2周,超过2周的完全培养基请谨慎使用。

注意:混合成完全培养基后必须充分混匀,2-8℃保存。整个过程确保无菌操作,各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。完全培养基使用前置于室温环境复温,切不可37℃水浴复温。

u 自备试剂:

l  基质胶(RegenGEL Ⅳ即用型基质胶,RC200126

l  细胞消化液(RegenTASE细胞消化液,RC200111

l  DMEM/F12培养基

l  细胞冻存液(细胞冻存液Ⅰ,RC200105

操作方法

1.        基质胶包被:取出即用型基质胶(RC200126),按一定量加入到培养器皿中,轻轻晃动使基质胶完全覆盖培养器皿底部。然后将培养器皿置于37℃细胞培养箱中孵育1-2小时。

注意:即用型基质胶为无菌产品,操作前使用75%酒精消毒表面,全部操作必须在无菌环境中进行。即用型基质胶在2-8℃具有较好的稳定性,若包被后不立即使用,可在保证无菌的情况下在2-8℃放置不超过1周。即用型基质胶包被时的添加量为24孔板300 μl/孔、12孔板500 μl/孔、6孔板1 ml/孔、10 cm培养皿10 ml/皿。

2.        细胞复苏:细胞复苏前准备好完全培养基,室温复温后置于超净工作台备用。从液氮中取出存储的多能干细胞(hESCshiPSCs),快速移入37℃水浴锅中融化,过程中轻柔晃动,至冻存管内剩余微小块冰即取出。75%酒精清洁后移入超净工作台。轻柔将细胞移入15 ml离心管,取5 ml完全培养基由慢到快加入离心管,轻轻混匀。220 g水平离心5分钟,弃去上清,加入完全培养基重新悬浮细胞。弃去以包被培养器皿中的即用型基质胶,将细胞接种于培养器皿中,使细胞均匀分布,置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。

注意:特别提醒培养基使用之前必须进行室温复温。离心需要使用水平转子,一般细胞实验室的离心机转速为1000/分钟。细胞沉淀重新悬浮是加入的培养基量依据实际情况自行计算,可以选择3倍接种密度的培养基体积重新悬浮,加入培养器皿后补加培养基;也可以直接稀释至接种密度进行重新悬浮,悬浮后直接接种于培养器皿。细胞重新悬浮可采用旋窝振荡或用移液器轻轻吹打。基质胶包被的培养器皿在弃去基质胶后立即使用,避免长时间空置导致表面干燥。培养器皿中培养基添加量推荐为24孔板1 ml/孔、12孔板1.5 ml/孔、6孔板2 ml/孔、10 cm培养皿10 ml/皿。

3.        培养与换液:24小时后,倒置显微镜观察细胞。弃去培养上清,更换已复温的新鲜完全培养基。若有较多漂浮细胞,弃去培养上清后用半量新鲜新鲜培养基轻柔地清洗一次,然后加入新鲜完全培养基。将器皿放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞培养箱继续培养。每24小时换液一次。

注意:细胞约3-5天生长至80%汇合,状态良好的hPSCs克隆明显,边缘光滑。

4.        传代:细胞生长至80%汇合后进行传代。弃去培养上清,细胞用DMEM/F12培养基洗2次,加入适量的RegenTASE消化液(RC200111),置于37℃培养箱中消化3-5分钟。每2分钟置于导致显微镜下观察,待克隆边缘发亮时即轻柔吸除消化液。加入适量的完全培养基轻柔吹打细胞数次,将细胞悬液移至离心管中,220 g离心5分钟。弃上清,轻轻振荡使细胞团块散开,加入适量的完全培养基重新悬浮细胞。按照合适的密度接种到已经包被好的培养器皿,使其均匀分布后放入培养箱继续培养。

注意:传代前按照前述步骤进行即用型基质胶包被细胞培养器皿,保障细胞处理好需要接种是培养器皿包被完成。RegenTASE的添加量为24孔板500 μl/孔、6孔板1 ml/孔、10 cm培养皿5 ml/皿。消化结束加入完全培养基的量为24孔板1 ml/孔、6孔板2 ml/孔、10 cm培养皿10 ml/皿,细胞轻柔吹打一般在10次以内。细胞重新悬浮接种时操作方式与复苏时的操作一致。

5.        冻存:细胞生长至80%汇合时进行细胞冻存。细胞收获方式同细胞传代。获取的细胞弃上清,轻轻振荡使细胞团块散开,加入适量的细胞冻存液Ⅰ(RC200105),轻轻吹打3-5次混匀细胞,移入冻存管中。

注意:传代前按照前述步骤进行即用型基质胶包被细胞培养器皿,保障细胞处理好需要接种是培养器皿包被完成。RegenTASE的添加量为24孔板500 μl/孔、6孔板1 ml/孔、10 cm培养皿5 ml/皿。消化结束加入完全培养基的量为24孔板1 ml/孔、6孔板2 ml/孔、10 cm培养皿10 ml/皿,细胞轻柔吹打一般在10次以内。细胞重新悬浮接种时操作方式与复苏时的操作一致。

特别提示:以上所有操作均在无菌细胞培养室进行,细胞开放操作要在生物安全柜内进行;该研究常用的培养器皿包括培养皿、培养板,也可自行设计方案使用细胞培养瓶、细胞工厂等,请根据实验需要自行选择;多能干细胞的初始状态对后续研究至关重要,请务必保证初始细胞未分化。该操作方法仅作为参考。


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