货号 | 产品名称 | 目录价(元) |
RC200122 | 人多能干细胞分化培养基 | 1380 |
产品特性
●诱导人类多能干细胞(ES/iPS)形成拟胚体
产品内容
试剂 | 规格 | 数量 | 运输 |
PSC 人类多能干细胞分化基础培养基
| mL | 1 瓶 | 冰袋 |
PSC 人类多能干细胞分化添加剂
| mL | 1 瓶 | 干冰 |
操作方法
1. 实验准备
人类多能干细胞分化培养基配制:
1.1 在2-8℃解冻人类多能干细胞分化添加剂,轻晃摇匀;
1.2 随后将添加剂加入到人类多能干细胞分化基础培养基中(每10mL添加剂与500mL分化基础培养基彻底混合)混匀即为人类多能干细胞分化培养基。人类多能干细胞分化培养基可在2-8℃稳定储存2-3周。
注意:
1.人类多能干细胞分化添加剂只能在2-8℃解冻,可按实际用量对添加剂进行分装,分装后立即使用或储存于-20℃至-80℃保存。
2.人类多能干细胞分化培养基使用前建议在室温平衡10-20min,不建议在37℃加热。
2.实验操作(以6孔板为例)
2.1 在显微镜下观察人类多能干细胞,确认细胞汇合度达到70–80%,准备传代。
2.2 清洗:拿出培养板,吸掉原有培养基,沿培养皿边缘缓慢加入37℃预热PBS缓冲液,轻轻晃动冲洗,然后吸去PBS缓冲液;
2.3 消化:在培养板中加入1.5mL人类多能干细胞无酶消化液使之
覆盖皿底,并置于37℃,5%CO2培养箱中孵育2~5 min;
注意:消化时间依据干细胞生长密度,如果密度中等且培养2~3天,消化时间可以控制在2 min~3min,若密度很大且培养4天以上消化时间可以控制在3 min~5min,消化时间快结束时可以拿到倒置显微镜下观察细胞消化情况,若在显微镜下观察到大部分克隆边缘以及克隆内部细胞间出现间隙,即刻吸掉无酶消化液停止消化。
2.4 吹打:吸掉人类多能干细胞无酶消化液后,立刻加入室温平衡好的人类多能干细胞分化培养基,用移液枪扇形吹打培养皿底,吹打次数保持在3~5次,使皿底贴附的干细胞集落脱落,轻柔缓慢吹吸混匀,制成干细胞悬液;
注意:吹吸皿底细胞的力度要轻柔,吹打脱落和吹吸混匀的次数在3~5次为宜,尽量避免形成单细胞。如有少量细胞无法从皿底脱落,属于正常现象。如有大量细胞无法从皿底脱落,需延长消化时间。
2.5制备拟胚体
2.5.1悬滴培养法制备拟胚体
A.稀释:将细胞悬液稀释,细胞密度约为1-2×105cells/mL;
B.制备悬滴:将稀释好的细胞悬液以30-50uL/滴(3000-7000 cells/滴),均匀接种在培养皿皿盖内面,翻转培养皿盖将其扣回加有PBS的培养皿上(加入PBS防止悬滴蒸发),放入37℃,5%CO2箱中培养;
C.3-4天后,非贴壁型培养皿中预先加入人类多能干细胞分化培养基,将培养皿盖上的悬滴转移至培养皿中(6cm培养皿加入3-4mL培养基)中,可观察到明显的拟胚体结构,轻轻晃动培养皿使拟胚体均匀分布在培养皿中继续培养。
2.5.2悬浮培养法制备拟胚体
A.稀释:将细胞悬液稀释,细胞密度约为2-5×105cells/mL;
B.接种:将稀释好的细胞悬液接种至非贴壁型培养皿内。
2.6换液
A.换液频率:使用悬滴法制备拟胚体,将悬滴接入非贴壁型培养皿继续培养后,每2-3天换一次液;使用悬浮培养法制备拟胚体,大约在第3天形成明显的拟胚体结构,可进行初次换液,后续每2-3天换一次液;
B.换液方法:将需换液的拟胚体悬液转移至15mL/50mL离心管中,静置约3min,待拟胚体沉降至管底,吸掉上清,加入室温平衡好的人类多能干细胞分化培养基,用巴士滴管轻轻转移至非贴壁型培养皿中,轻轻晃动培养皿使之均匀分布在培养皿中,37℃,5%CO2培养箱中继续培养。
细胞形态图
拟胚体形态图