人多能干细胞（human pluripotent stem cells，hPSCs）包括人胚胎干细胞（hESCs）和诱导性多潜能干细胞（iPSCs）。体外hPSCs定向肝细胞、肺细胞、胰岛细胞等方向分化均需要先分化为定型内胚层细胞（definitive endoderm cells）。定型内胚层经典的分化方法用时3天，因分化过程中添加高浓度的活化素A（100 ng/ml，Activin A），会导致分化的同时细胞大量死亡。为提高细胞存活率，通常会添加一定浓度的血清。但血清成分复杂，提高细胞存活率的同时也严重影响分化效率（使用血清后流式检测定型内胚层细胞标志物SOX17及FOXA2往往低于50%）。这也最终导致肝细胞、肺细胞、胰岛细胞等终末分化细胞分化效率更低，难以满足下游实验的需求。本产品主要针对定型内胚层分化过程中细胞大量死亡和血清导致的分化效率低下进行产品优化，最终形成无血清培养方案，明显降低了诱导过程中的细胞死亡率，且诱导后流式/免疫荧光检测定型内胚层细胞标志物SOX17及FOXA2阳性率较高。

操作方法

实验准备

u 诱导培养基配制：

1. 血清替代品处理：室温解冻血清替代品（RC200127）。融化后轻轻充分摇匀，分装备用，或直接以20%的比例添加到RPMI1640培养基中。分装后立即存储于-80 ℃，避免反复冻融。

注意：室温解冻有利于保护血清替代品中营养物质不被破坏，切不可置于37℃水浴剧烈解冻，解冻后请务必充分混匀，以保证添加物的均匀度。

2. 诱导培养基配制：将血清替代品（RC200127）以20%比例加入到RPMI1640培养基中，充分混匀，即配制成诱导培养基。使用时根据情况添加Activin A和CHIR99021（工作浓度Activin A为100 ng/ml，CHIR99021为2 μM）。

注意：混合成诱导培养基必须充分混匀，2-8℃保存。整个过程确保无菌操作，试剂开封前以75%酒精擦拭表面。诱导培养基使用前置于室温环境复温，该操作适用于下列所有用到诱导培养基的步骤。

u 自备试剂：

l 多能干细胞完全培养基

l 细胞消化液

l 无钙镁的磷酸盐缓冲液（DPBS）

l RPMI1640培养基

l Activin A

l CHIR99021

操作方法

1. 待分化细胞接种：分化前一天消化，接种hESCs/iPSCs。以24孔板进行诱导分化为例，确保分化开始加入诱导培养基时细胞汇合度大于90%，细胞贴壁时间大约为12-16小时。

注意：hESCs/iPSCs 复苏后状态较差，建议传代数次调整细胞状态后种板开始诱导分化，建议传代3次后开始种板诱导分化。细胞状态和细胞培养中需要注意的细节，细胞消化、离心时间等可参考多能干细胞相关产品（RC200120、RC200121、RC200111）的相关说明。

2. 诱导起始：弃去培养上清，用诱导培养基轻柔地洗涤细胞2次。按照培养器皿的参考培养基添加量加入诱导培养基（含Activin A，含CHIR99021）。将器皿放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱进行培养。诱导培养基的参考添加量为24孔板500 μl/孔、6孔板2 ml/孔、10 cm培养皿15 ml/皿。

注意：特别提醒诱导培养基使用之前必须复温。

3. 换液诱导：诱导24小时后，倒置显微镜观察细胞。按照培养器皿的参考培养基添加量加入诱导培养基（含Activin A，含CHIR99021）。将器皿放入37℃、5%CO₂、饱和湿度的细胞培养箱继续培养。每天换液，继续诱导至72小时。

注意：诱导培养会对细胞进行筛选，细胞死亡为正常现象。经过72小时诱导后，细胞汇合度应大于80%。诱导培养基使用之前必须复温，提前室温放置复温即可，切不可37℃水浴复温。

4. 标志物检测：经过72小时诱导，细胞汇合度大于80%。定型内胚层细胞呈三角形或多角形，流式细胞术检测SOX17阳性率。

注意：该诱导终点只是其他实验的起点，诱导终点的细胞难以长时间稳定在该状态，需要尽快进入后续实验（大于72小时细胞会出现凋亡，因此需要每天固定时间点进行实验），如肝脏细胞、胰岛细胞、肺细胞等的诱导分化程序等。

特别提示：以上所有操作均在无菌细胞培养室进行，细胞开放操作要在生物安全柜内进行；该研究常用的培养器皿包括培养皿、培养板，也可自行设计方案使用细胞培养瓶、细胞工厂等，请根据实验需要自行选择；多能干细胞的初始状态对分化的成功至关重要，请务必保证初始细胞未分化。该产品仅用于多能干细胞向定型内胚层分化的研究，用于其他研究时该操作规程仅作为参考。

细胞形态展示：

鉴定结果：

应用示例：

1. 人胚胎干细胞源肺类器官分化

2. 人胚胎干细胞源肝细胞分化

参考文献

1. Chen, Y; Feng, J; Zhao, S; Han, L; Yang, H; Lin, Y; Rong, Z; Long-Term Engraftment Promotes Differentiation of Alveolar Epithelial Cells from Human Embryonic Stem Cell Derived Lung Organoids, Stem cells and development, 2018, 27(19): 1339-1349.

2. Li, Q; Hutchins, A. P; Chen, Y; Li, S; Shan, Y; Liao, B; Zheng, D; Shi, X; Li, Y; Chan, W; Pan, G; Wei, S; Shu, X; Pei, D; A sequential EMT-MET mechanism drives the differentiation of human embryonic stem cells towards hepatocytes, Nature communications, 2017, 8(1): 1-12.

与描述相符