|
收藏
产品编号 RC200134
人肾类器官分化试剂盒 仅用于科学研究 产品信息 产品名称:人肾类器官分化试剂盒 货号:RC200134 批号:见包装 试剂清单:
存储与有效期: 组分1、2、3、4于-20至-80 ℃避光保存,必须避免反复冻融;首次完全解冻后可以按使用量进行分装,置于-20至-80 ℃长期保存;2-8 ℃条件下,稳定储存2周。组分5于2-8℃避光保存,有效期1年。 适用范围: 本试剂盒适用于人多能干细胞(胚胎干细胞、诱导多能干细胞)定向肾系细胞分化,同时进行立体培养,形成血管化肾类器官。 产品介绍 类器官与悬浮培养是当前再生医学研究与应用的前沿,是未来再生医学与组织工程发展的趋势。为适应日益发展的科研需求,并为生命科学尤其是再生医学研究的需要,开发优化了相关产品,可以为科研工作者提供稳定的研究平台,以助力研究的时效性和经济性。该产品设计同时考虑再生医学临床前研究的需求,可以为研究人员提供大量稳定的种子细胞,加速应用后期技术的研发。 本产品无血清、成分明确、含有细胞保护因子,适合于人多能干细胞向血管化肾类器官的诱导。 操作方法 实验准备 u 完全培养基准备: 组分1-4(S1、S2、S3、S4)均为完全培养基:2-8℃解冻。完全融化后轻轻摇匀,可以按照实际使用量分装。分装后立即存储于-20至-80 ℃,避免反复冻融。 注意:2-8℃冰箱过夜,切不可置于37℃水浴剧烈解冻,解冻后请务必充分混匀,以保证培养基成分的均匀度。冷冻组分解冻时会有絮状沉淀或结晶,每次使用前混合均匀使用即可,不影响使用效果。 u 自备试剂耗材: l 多能干细胞完全培养基(推荐使用mTesR1培养系统) l 多能干细胞消化液(Accutase等) l 基质胶 l 贴壁细胞培养板 l 低吸附细胞培养板 l Rock抑制剂(Y27632) l 细胞固定液(2-4%中性多聚甲醛) 操作方法 1. S1阶段:人多能干细胞生长至约60%汇合开始血管化的肾类器官诱导分化,要求人多能干细胞克隆形态良好。用基础培养基(RC200134-5)每孔2-3 ml洗细胞2次,加入S1完全培养基每孔2 ml,每天换液,连续4天。该阶段为原条诱导阶段(primitive streak)。有部分细胞死亡为正常现象。 注意:本操作方案以六孔板为例,若使用其他器皿可以根据需要自行调整方案。调整方案时建议以细胞密度为稳定因素。细胞培养箱条件为37℃、5% CO2、饱和湿度。所有培养基在使用前必须进行室温复温。这些注意事项同样适用于以下步骤。 注意:起始的多能干细胞(ES、iPSC)对后续诱导成功非常关键,请务必保证诱导时多能干细胞生长状态良好,50-60%汇合(参考诱导形态示例图)。该阶段诱导过程中有部分细胞死亡为正常现象。 2. S2阶段:诱导第5天,用基础培养基每孔2-3 ml轻柔洗细胞2次,加入S2完全培养基每孔2 ml,每天换液,连续3天。该阶段为肾中胚层特化阶段(kidney mesodermal specialization)。 注意:移液枪吹打细胞时务必轻柔,切不可产生大量气泡,本试剂盒全程均需注意此问题。 3. S3阶段:诱导第8天,用基础培养基每孔2-3 ml轻柔洗细胞2次,加入S3完全培养基每孔2 ml,每天换液,连续4天。该阶段为肾祖细胞阶段(nephronic progenitor cells)。 4. S4阶段:诱导第12天,用DPBS每孔2-3 ml轻柔洗细胞2次,加入适量(每孔1 ml)消化液Accutase(Gibco,货号A1110501),同时加入终浓度为10 μM的Rock抑制剂(Y27632)以提高细胞存活率。细胞消化约3-6分钟,待细胞易吹下即加入适量(每孔1-2 ml)S4完全培养基终止消化。收集细胞悬液到离心管中,800 转/分离心5分钟,弃上清;用适量S4完全培养基重悬细胞,同时加入终浓度为10 μM的Rock抑制剂(Y27632)。细胞接种于低黏附的培养器皿,6孔板一个孔消化的细胞接种于1个低黏附6孔板的一个孔,S4完全培养基加入量为每孔2-3 ml,每天用S4完全培养基每孔2-3 ml换液(不需添加Rock抑制剂)。培养过程中可通过低速离心的方式去除死细胞。若细胞团块过大,可以用枪头轻柔吹打至均一大小,继续培养至第24-26天。该阶段为相对成熟的阶段(maturation of kidney cells)。 注意:低速离心的方法为,收集细胞悬液,置于离心管中,建议200转/分,离心3-5分钟,弃上清。死细胞不会沉底,弃上清即可去除死细胞。细胞沉淀用完全培养基重悬,继续培养。 注意:S4阶段诱导过夜后细胞便会聚团成球(参考诱导形态示例图),若此时成球不明显,则后续成功的可能性很小,请注意根据形态示例图判断。 注意:继续培养过程中,若细胞团数量过多,可适当分到其他孔中继续培养。 5. 推荐检测:第0天、5天、12天及24-26天的各阶段标志物。第0天检测多能干细胞标志物,如OCT4、SOX2等;第5天检测原条阶段的标志物,如T/Brachyury、MIXL1等;第12天检测肾相关标志物,如SIX2、SALL1、NPHS1等,此阶段起可检测血管标志物KDR等;第24天检测相对成熟肾标志物,如JAG1、CDH1、LTL、AQP1、NPHS1、CD31、KDR等。 特别提示:以上所有操作均在无菌细胞培养室进行,细胞开放操作要在生物安全柜内进行;该研究常用的培养器皿包括培养皿、培养板,也可自行设计方案使用细胞培养瓶、细胞工厂等,请根据实验需要自行选择;细胞的初始状态对分化的成功至关重要,请务必保证初始细胞的可靠性。该试剂盒仅用于定型内胚层细胞向肾类器官分化的研究,用于其他研究时该操作规程仅作为参考。 诱导过程示意图: 诱导形态示例图: 各阶段单独加购价格:
|