FY200007 人间充质干细胞成脂诱导试剂盒V1.3.pdf

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人间充质干细胞成脂诱导试剂盒

仅用于科学研究

产品信息

产品名称：人间充质干细胞成脂诱导试剂盒

货号：FY200007

批号：见包装

存储与有效期：

组分A、D、E于2-8 ℃避光保存，组分B、C于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存，有效期1个月。

适用细胞：

人骨髓间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞，其他组织来源的人间充质干细胞。

产品介绍

间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。

为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定，弗元生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒，在稳定性、易用性上大幅改进，采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途，首先，用于鉴定人MSC是否具有成脂分化能力，满足MSC质量控制的要求。其次，诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、油脂定量检测、免疫组化检测等。再者，该产品诱导MSC分化为的脂肪细胞多为多泡脂肪细胞样，当脂肪滴融合过大时容易脱壁，难见单泡脂肪细胞样。用于脂肪研究可斟酌使用本产品。

本产品仅适用于科学研究。

操作方法

实验准备

u 试剂配制：

诱导液B：2-8℃过夜融化添加物B液，B液使用前须37℃复温30分钟，充分混匀。将基础培养基A液平均分成2份，各45 ml，加入添加物B液配制成完全诱导培养基B，充分混匀。

诱导液C：2-8℃过夜融化添加物C液，加入基础培养基A液的另一份45 ml，配制成完全诱导培养基C，充分混匀。

注意：添加物B液必须充分复温，内容物充分解冻为透明无沉淀。混合成诱导完全培养基后必须充分混匀，2-8 ℃保存。整个过程须确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。

油红O染液（工作液）：取油红O储液，与蒸馏水以3：2的比例混合均匀，中性滤纸过滤，即配制成了油红O染液（工作液）。

u 培养皿处理：

加适量包被溶液D液到培养器皿中，轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面，室温静置30-60分钟。弃去溶液，室温晾干。

注意：包被液C使用前必须进行室温复温。建议使用六孔板，每孔加D液1 ml，使用其他培养器皿时需考虑实验结果的稳定性。整个过程需在超净工作台中操作，避免污染。

u 自备试剂：

l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）

l  磷酸盐缓冲液（DPBS）

l  MSC完全培养基

l  4%中性多聚甲醛溶液

注意：若MSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间。

操作步骤

1.      准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用MSC完全培养基重悬。

2.      按照3×10⁴ cells/cm²的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中，每孔MSC完全培养基2 ml，37℃、5%CO₂培养箱中培养。

注意：细胞密度为该试剂盒的标准密度，可根据实验室情况进行调整，调整依据参照所检测MSC正常传代的密度的2倍接种，培养24小时后添加诱导培养完全培养基；或接种密度低，待细胞生长至下一步要求的密度后进行诱导。

3.      当细胞融合达90%时，弃去培养上清，每孔添加诱导液B 2 ml/孔，37℃、5%CO₂培养。

注意：成脂诱导后细胞易脱壁，换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔，沿培养器皿侧壁缓缓加入，避免吹起细胞。细胞起始诱导融合度对诱导效果十分关键，必须确保细胞生长至足够密时再进行诱导。

4.      诱导培养72 小时后弃去原培养上清，添加诱导液C 2 ml/孔，37℃、5%CO₂继续培养。

5.      继续诱导培养24 小时后弃去原培养基，添加诱导液B 2 ml/孔，37℃、5%CO₂继续培养。

6.      重复步骤4、5约3-5次，待细胞内出现明显脂滴时更换为诱导液C继续培养。

7.       注意：一般在培养4天左右高倍镜下能看到细胞浆内有较多数量的圆形亮泡，5-9天融合为较大的亮泡，这些结构围绕在细胞核周围，较大的与细胞核大小相当。状态较好的细胞10天内可结束培养过程，若10天后仍未见脂滴结构，请注意分析操作步骤与其他原因。

8.      每2天更换新鲜诱导液C，继续培养至脂滴足够大时培养结束。

注意：换液时诱导液必须经过复温，否则影响诱导效果和可能导致细胞脱壁。根据实验需要选择培养结束时间，若成脂面积过大或脂滴过大导致连成片则不利于结果的呈现，建议提前终止。不同实验室MSC诱导时出现脂滴的时间不尽相同，若大面积出现脂滴较早，则可提前更换为诱导液C。

9.      诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室温固定细胞20分钟。

注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己的检测方法则后续方案需要自己拟定。

10.  弃去固定液，DPBS洗2次，加入油红O染液（工作液）1 ml/孔染色15分钟。

注意：该步骤适用于鉴定成脂能力，若出现脂滴（脂肪细胞）则会呈现红色着色。若需要得到美观的图片，则染色时间需自己掌握。

11.  弃去油红O染液（工作液），DPBS洗3次。

注意：染色后肉眼可见孔内明显染红。染色过程中一定要避免组织细胞被风干，风干会影响显微观察效果。

12.  显微镜下观察并拍照。

注意：拍照一般选用高倍镜，请根据需要确认选择。

13.  结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见大面积红色着色点，20倍和40倍镜下可观察到红色球形在细胞内的情况，此红色着色球为脂滴，说明实验所用的MSC具有成脂能力。否则，所使用的MSC无成脂能力。

注意：该判定标准仅进行定性分析，若需要进行定量分析，需要自行制定方案。