杨波. 原花青素通过抑制TLR4-NLRP3通路对脑缺血再灌注损伤的保护作用研究[D].南方医科大学,2022.DOI:10.27003/d.cnki.gojyu.2022.000267.

杨波

南方医科大学

摘要：研究背景和目的缺血性脑卒中是由于大脑局部区域的血液供应中断而导致的死亡或永久性神经功能缺损,被列为全球三大死亡原因之一。根据世界卫生组织的数据,每年约有1500万人患有中风,约30%的患者无法幸存。此外,幸存的患者中有80%面临长期的身体功能和认知功能的障碍,临床表现为一侧肢体无力,部分患者会表现为言语障碍,严重者会出现偏瘫,甚至会直接导致昏迷、脑疝、甚至死亡,同时造成严重的社会负担和家庭经济压力。目前治疗缺血性中风的策略是及时恢复缺血区域的血液灌注。重组组织纤溶酶原激活剂是美国食品和药物管理局批准的药物,可用于治疗急性脑缺血性疾病。但是,它有许多缺点和局限性,例如脑出血、治疗时间窗短及疗效的不确定性,尤其是在缺血脑组织再灌注后仍出现进行性神经损害。因此,有必要研究脑缺血再灌注损伤的复杂病理机制,并提出更有效的治疗策略。近年来,大量研究证据表明炎症是导致脑缺血再灌注后致病过程的主要因素。经过多年的探索,证明Toll样受体是哺乳动物中重要的先天免疫模式识别受体,可以识别病原体相关分子模式。生物信息数据库中,可以看到TLR4-NLRP3炎症通路普遍存在于生物体内,激活的TLR4可以诱导多种炎症细胞因子的表达,包括IL-1β,TNF-α和IL-6等。作为触发炎症的整合平台,炎症小体可以在脑缺血再灌注后被激活并启动先天免疫应答。其中先天性传感器NOD样受体蛋白(NLRP3),可以被多种病原体/损伤相关分子模式(PAMPs/DAMPs)激活,从而调节宿主细胞对感染和损伤的反应。此外,广泛的研究表明,活化的NLRP3炎性体也可以通过炎症反应加重脑损伤和神经系统疾病。许多研究发现,多酚黄酮类物质可以通过抑制氧化应激、减少炎症反应、调控疾病相关基因的表达等方面,在预防疾病中发挥作用。原花青素(PC)是植物界中一类大的多酚黄酮类化合物的总称。其分子结构中含有多个羟基结构,能够与氧自由基充分结合,起到抗氧化、减轻炎症的作用。自从20世纪80年代以来,通过对多种植物提取的原花青素进行药物活性及其生物活性的多项研究,结果显示:原花青素是一类很强的抗氧化物质,在减轻炎症反应、抗氧化治疗、抗肿瘤治疗及保护心血管系统等多方面表现出良好的应用空间,为本课题的设计提供了新的思路。在本项研究中,我们假设TLR4-NLRP3通路参与了脑组织缺血再灌注损伤的发生和发展,而原花青素可以通过对TLR4-NLRP3通路的抑制,在脑组织缺血再灌注损伤中起到保护作用。目的、方法、结果与结论1.原花青素对大鼠大脑中动脉闭塞(MCAO)后再灌注损伤的大鼠脑组织梗塞面积、神经细胞形态、脑水肿含量和神经学功能评分的影响:研究目的:通过TTC染色、脑水肿含量测定、行为测试、H&E染色、尼氏体染色等,评价原花青素是否对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用,同时为下一步实验获取脑组织蛋白标本。研究方法:使用Longa的建立大鼠脑缺血再灌注模型(MCAO模型)的方法,将SD大鼠(雄性,体重180g-220g)随机分为六组:假手术组,模型组,模型+原花青素(20、40、80 mg/kg)组和假手术+原花青素组。闭塞前1h胃内注入原花青素,MCAO 2 h后再灌注,再过24 h进行神经功能学评分,评分后处死。然后,快速提取大鼠脑组织以检测原花青素是否可以改善MCAO/R引起的脑梗死体积和水肿。TTC染色=4只大鼠,H&E染色=4只大鼠,尼氏体染色=4只大鼠,行为测试=8只。在神经学评分结束时,将大鼠进行脑水含量和蛋白质印迹等后续测试,其中脑水含量=4只大鼠,蛋白质印迹=4只大鼠。研究结果:①、结果表明,与假手术大鼠相比,MCAO/R显著增加了脑梗死体积,而原花青素则明显减轻了这种作用。②、原花青素可以缓解MCAO/R引起的脑水肿。③、原花青素可以减轻MCAO/R导致的细胞死亡。④、与假手术组相比,MCAO/R显著增加了神经学评分,而原花青素可减轻这些作用。研究结论:原花青素可以通过减少MCAO/R引起的大鼠脑梗死体积、减轻大鼠MCAO/R引起脑水肿量、降低由大鼠MCAO/R引起的神经功能评分升高、增加存活神经元的数量来减轻大鼠MCAO/R导致的脑组织损伤。2.原花青素对大脑中动脉闭塞后再灌注(MCAO/R)大鼠脑蛋白中凋亡蛋白和TLR4-NLRP3信号通路蛋白表达水平的影响。研究目的:本课题第一部分在动物实验水平证实了,原花青素对大鼠MCAO/R后的神经损伤具有保护作用。本部分自分子水平进一步证实,原花青素是否通过抑制TLR4-NLRP3信号通路的激活,对大鼠大脑中动脉闭塞再灌注后起到保护作用。研究方法:行为测试后处死大鼠,将脑组织在改良的RIPA缓冲液(含蛋白酶抑制剂混合物)中匀浆,然后在4℃下以12,000×g离心15分钟,并收集上清液。通过BCA蛋白质测定法测定蛋白质浓度,并将适当量的蛋白质用于电泳。通过蛋白质印迹分析确定各组大鼠脑蛋白中Bcl2、Bax、TLR4、p-p38、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β、和β-actin的表达水平。使用分子成像仪采集数据并使用数量进行分析。研究结果:①、MCAO/R组与对照组相比较,Bax的蛋白表达水平和Bax/Bcl-2的蛋白比例显著增加,而Bcl-2的蛋白表达水平明显降低。但是,用原花青素预处理可以消除MCAO/R诱导的大鼠细胞凋亡相关蛋白的上调。②、原花青素可以抑制MCAO/R诱导的大鼠TLR4-NLRP3信号通路的激活,降低炎性介质 caspase-1、IL-1β 的表达。研究结论:原花青素在体内可以抑制MCAO/R引起的凋亡,下调MCAO/R诱导的TLR4-NLRP3炎性信号通路的激活。3.原花青素对OGD/R诱导的BV2细胞中TLR4-NLRP3信号通路的影响及分子机制。研究目的:本课题第一、二部分在动物实验、分子水平证实了原花青素可以抑制MCAO/R诱导的大鼠TLR4-NLRP3信号通路的激活,降低炎性介质caspase-1、IL-1β的表达,进而对大鼠脑缺血再灌注损伤后起到保护作用。本部实验主要通过细胞学实验进一步验证原花青素是否通过TLR4-NLRP3信号通路对BV2细胞在OGD/R下起到保护作用及分子机制。研究方法:先用无糖DMEM培养基在OGD(5%CO2、94%N2、1%O2)条件下孵育BV2细胞2 h,再用DMEM培养基在正常氧气下培养22h。检测原花青素(5 μM,10 μM 和 20 μM)组 TLR4、p-p38、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β和β-actin 水平。根据以上实验结果,用含10 μM原花青素(procyanidins)无糖DMEM培养基在OGD(5%CO2、94%N2、1%O2)条件下分别孵育细胞1 h、2 h、3 h和4h,再用DMEM培养基在正常氧气下分别培养23h、22h、21h、20h。分别检测TLR4、p-p38、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β和β-actin 水平。接下来,在OGD/R条件下,检验不同浓度的原花青素(0.01-100μM)对BV2细胞的影响。结果表明,OGD/R暴露和低剂量的原花青素(0.01-10μM)对正常BV2细胞无明显作用。但是,原花青素100μM可以降低BV2细胞的活力,IC50值为8.7μM。根据以上实验结果,在以下实验中我们将原花青素的剂量设置为10μM,在DMEM培养基中的潮湿低氧室中于5%CO2、94%N2和1%O2的气氛中培养6小时,然后在常氧条件下培养18小时建立OGD/R模型。原花青素+OGD/R组及OGD/R组行免疫荧光实验,去检验BV2细胞中TLR4、NLRP3的蛋白的表达水平。接着,我们将原花青素和Cli-095以相应浓度溶解在不含葡萄糖的DMEM培养基中建立OGD/R模型,使用蛋白质印迹分析实验(Western blotting)检测BV2 细胞中 TLR4、p-p38、p-NF-κB/NF-κB、NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β和β-actin的蛋白的表达水平。研究结果:①、在 OGD(5%CO2、94%N2、1%O2)条件下,TLR4、p-p38、p-NF-κB、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白水平随原花青素浓度的增高显著降低,且随着浓度越高,趋势越明显。TLR4、p-p38、p-NF-κB、NLRP3、caspase-1、IL-1β蛋白水平均在与原花青素培养后显著降低,且随着时间延长,趋势越明显。原花青素100μM可以降低BV2细胞的活力,IC50值为8.7μM。因此我们设定的实验条件是:花青素的剂量设置为10μM,在DMEM培养基中的潮湿低氧室中于5%CO2、94%N2和1%O2的气氛中培养6小时,然后在常氧条件下培养18小时建立OGD/R模型。②、免疫荧光实验证实:1、NLRP3、TLR4荧光定位于细胞内。2、与原花青素组相比,OGD/R组中NLRP3、TLR4荧光强度显著升高。③、原花青素可以抑制OGD/R诱导的BV2细胞中TLR4-NLRP3信号通路激活,caspase-1和IL-1β的表达水平升高。原花青素在体外的实验结果,与用Cli-095预处理结果相同。研究结论:原花青素在体外可以通过下调OGD/R诱导的TLR4-NLRP3炎性信号通路引起的神经炎症反应对神经细胞起到保护作用,且与时间、浓度相关。