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01操作步骤
01
1.1 细胞准备。
1.1.1 正常冻存的细胞。从液氮中取出,37℃快速融化,5倍完全培养基稀释,混匀15 ml离心管,200 g离心5分钟,弃上清。
1.1.2 正常培养的细胞。弃去培养上清,DPBS洗细胞两次,加入胰酶消化液1 ml,室温消化1分钟,加入3 ml间充质干细胞完全培养基终止消化。轻轻吹打细胞,移入15 ml离心管,200 g离心5分钟,弃上清。
1.2 细胞重悬。漩涡震荡使细胞分散,5 ml 缓冲液(含0.5% BSA的DPBS)洗细胞两次,弃上清。细胞以4 ml缓冲液重新悬浮。
1.3 抗体孵育。分别将抗体、同型对照(同型对照抗体混合到1个反应中)5 μl(按照抗体说明书上细胞数对应的抗体量添加)加入离心管中,分别加200 μl/管细胞悬液,漩涡混匀,室温、避光孵育15 分钟。
1.4 上机准备。
1.4.1 细胞不进行固定处理。加5 ml缓冲液/管,200 g离心5 分钟,弃上清,细胞沉淀以200 μl缓冲液重新悬浮,4 ℃避光,30 分钟内上机检测。
1.4.2 细胞进行固定处理。加5 ml缓冲液/管,200 g离心5 分钟,弃上清,细胞沉淀以200 μl的1%中性多聚甲醛溶液重新悬浮,4 ℃避光,30 分钟内上机检测。
1.5 上机检测。空白对照、同型对照与目标抗体染色的细胞分别上机,以空白对照和同型对照设定参数,以此参数对样本数据进行采集,收集有效细胞数20000个。
1.6 分析。
02注意事项
02
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