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弗元生物-专业的干细胞培养基 >> 资 料 >>技术资料 >> 流式检测方法(细胞表面标志物)
详细内容

流式检测方法(细胞表面标志物)

01

操作步骤

  1. 1.1 细胞准备。

  2.     1.1.1 正常冻存的细胞。从液氮中取出,37℃快速融化,5倍完全培养基稀释,混匀15 ml离心管,200 g离心5分钟,弃上清。

  3.     1.1.2 正常培养的细胞。弃去培养上清,DPBS洗细胞两次,加入胰酶消化液1 ml,室温消化1分钟,加入3 ml间充质干细胞完全培养基终止消化。轻轻吹打细胞,移入15 ml离心管,200 g离心5分钟,弃上清。

  4. 1.2 细胞重悬。漩涡震荡使细胞分散,5 ml 缓冲液(含0.5% BSA的DPBS)洗细胞两次,弃上清。细胞以4 ml缓冲液重新悬浮。

  5. 1.3 抗体孵育。分别将抗体、同型对照(同型对照抗体混合到1个反应中)5 μl(按照抗体说明书上细胞数对应的抗体量添加)加入离心管中,分别加200 μl/管细胞悬液,漩涡混匀,室温、避光孵育15 分钟。

  6. 1.4 上机准备。

  7.     1.4.1 细胞不进行固定处理。加5 ml缓冲液/管,200 g离心5 分钟,弃上清,细胞沉淀以200 μl缓冲液重新悬浮,4 ℃避光,30 分钟内上机检测。

  8.     1.4.2 细胞进行固定处理。加5 ml缓冲液/管,200 g离心5 分钟,弃上清,细胞沉淀以200 μl的1%中性多聚甲醛溶液重新悬浮,4 ℃避光,30 分钟内上机检测。

  9. 1.5 上机检测。空白对照、同型对照与目标抗体染色的细胞分别上机,以空白对照和同型对照设定参数,以此参数对样本数据进行采集,收集有效细胞数20000个。

  10. 1.6 分析。


02

注意事项

  1. 2.1 本方法的适用范围。细胞表面标志物的检测。
  2. 2.2 细胞。理论上细胞只需要保持单个细胞在缓冲体系中的悬浮状态。正在培养的细胞和冻存细胞均可进行检测。实际操作中多使用培养中的细胞进行检测,冻存细胞检测时细胞的离散性更大。
  3. 2.3 抗体:除了抗体的物种等适用性、抗体所携带的荧光与机器的匹配以外,还需要注意,
  4.     2.3.1 抗体对应的抗原是变性的还是正常状态的,如果对应的是固定状态的,则在抗体孵育前可能需要用多聚甲醛进行固定;
  5.     2.3.2 需要用到荧光二抗的,抗体配对与待检测物种之间尽量避免相同。
  6. 2.4  细胞量与抗体量。表面标志最终细胞分析数量一般在10000到30000,以此推算开始每个反应的细胞数最好不低于100000个。在处理过程和检测过程中均会有不同程度的细胞丢失,若是使用二抗则数量还需要增加。抗体的添加量与细胞数相关,一般专用抗体的说明书有相关的描述,按照说明书的要求比例添加。
  7. 2.5 抗体孵育后的固定。一般抗体孵育后需要进行固定,固定后的数据更稳定。
  8. 2.6 缓冲液。缓冲液中加入BSA具有一定的非特异结合封闭功能,对细胞也保护作用,建议添加。
  9. 2.7 离心力。一般细胞培养实验室的水平离心机选择1000 rpm。离心力过大,影响细胞状态,一些细胞碎片等杂质影响检测效果。离心力过小容易细胞丢失。
  10. 2.8 细胞团块。流式检测需要细胞呈单个悬浮,若有明显的细胞团块,可以用200-300目的细胞滤网过滤后再进行抗体孵育和后续操作。若检测前发现细胞团块,也可以上机前进行细胞滤网过滤,或者直接用小枪头将团块吸出。
  11. 2.9 细胞碎片处理。若细胞碎片过多,可以采用低速短时离心的方法去除。如800转3分钟,轻轻将上清吸弃。
  12. 2.10 避免交叉污染。几种抗体同时检测时,避免枪头等可能导致交叉的情况。如弃去液体后避免污染共用操作面,避免加液枪头碰触可能有抗体的离心管口等。


希望能对操作人员有所帮助,能解决实际问题,满足实际需求。

有相关技术问题,请联系弗元生物。

弗元生物出品,转载务必联系!


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