传代消化在间充质干细胞培养中至关重要，对于间充质干细胞消化的理解往往是导致传代失败的原因。这里，弗元生物将根据朋友们遇到的各种状况总结整理间充质干细胞传代时胰酶的使用方法，并尽量一针见血地解释底层原理与操作细节的关系。

在贴壁细胞培养中，胰酶消化是常见且关键的步骤。其操作方案主要有两种：

第一种，先去除培养基，用 DPBS 清洗细胞，弃掉 DPBS 后加入胰酶进行消化，待消化至一定程度，直接加入终止液（含血清的完全培养基或专用胰酶终止液），通过吹打或震动使细胞悬浮，随后收集细胞悬液，经离心处理，弃去上清液，最后用新的完全培养基重新悬浮细胞并接种。

第二种，同样先去除培养基并用 DPBS 清洗，弃掉 DPBS 后加胰酶消化，消化完成后，弃掉胰酶再加入终止液，后续步骤与第一种相同，即吹打悬浮细胞、收集悬液、离心、弃上清、重悬接种。此外，还有一些简化操作，即不弃胰酶也不离心，直接接种，但这种方法仅适用于对胰酶和EDTA不敏感的细胞，对间充质干细胞并不适用。

直接说结论，间充质干细胞消化必须采用第一种方案。接下来从多个角度详细解释原因。

先看胰酶消化液的特性。常规胰酶消化液含有胰酶和 EDTA 两种有效成分。胰酶能够特异性地切断蛋白质中由赖氨酸或精氨酸的羧基所形成的肽键，正因如此，它能广泛作用于多种蛋白质，属于广谱的蛋白水解酶。但也正因为其作用广泛，如果消化时间过长，就会对细胞造成伤害。同时，胰酶发挥活性对环境有要求，钙镁离子会抑制其活性，血清中也含有大量胰酶抑制剂，所以要用不含钙镁离子的 DPBS 清洗细胞，去除含血清的完全培养基。

再从间充质干细胞的特性分析。体外培养的贴壁细胞大致分为间质类细胞和上皮类细胞，间充质干细胞属于间质类，贴壁相对不牢固。加入胰酶后，间充质干细胞会先被消化下来，而上皮类细胞则较难消化。在原代细胞培养中，细胞往往不纯，利用间充质干细胞易被消化的特性，收集先消化下来的细胞，丢弃不易消化的上皮类细胞，是获得较高纯度间充质干细胞的常用方法。此外，贴壁细胞在分裂时处于半贴壁状态，这类活性好的细胞也更容易被胰酶消化下来。

还有三个关键要点需要注意。一是胰酶消化液不能直接丢弃，其中的 EDTA 成分有助于分散细胞，防止蛋白凝结成团，弃掉消化液可能导致细胞凝聚。二是必须彻底终止消化，加入足量的终止液。若不终止或终止不完全，在离心过程中胰酶会继续消化细胞，间充质干细胞会受到严重损伤。三是必须加入足量体积的胰酶消化液，避免因体积不足导致消化不均匀或效果不佳，确保每个细胞都能充分浸没在消化液中，少加消化液绝对不可取。

总结来说，选择 DPBS 是因其不含钙镁离子，有利于胰酶发挥活性；间充质的特性是很容易脱壁；操作的细节问题隐藏在基本特性中。掌握这些要点，才能保障间充质干细胞传代过程中胰酶消化步骤的顺利进行。有什么问题可以联系弗元生物技术人员，有问题即时解决、事前解决。