准备：提前备好冻存管、冻存盒/程序降温仪、冻存液等所有所需物品；在冻存管上清晰标记细胞名称、传代次数、冻存日期；自己配制冻存液的需要先配制好，备用。
细胞收集：选取对数生长期的优质细胞，按常规传代方法消化，加入基础培养基终止消化，轻柔吹打制成单细胞悬液，离心收集细胞。
加冻存液：吸弃离心后的细胞上清，轻轻拨动离心管底部使细胞充分分散，再加入适量冻存液（常规配比：20%胎牛血清+60-65%基础培养基+5-10%DMSO）并迅速混匀。
分装：将混匀后的细胞悬液快速分装至已标记的冻存管中。
程序降温：将分装好的冻存管放入预冷的程序降温盒或程序降温仪，按设定程序降温至-80℃。
长期保存：待降温完成后，将冻存管移入液氮罐中长期保存；程序降温盒过夜后转移到液氮长期保存。
冻存管：优先选用内旋盖冻存管，使用前需仔细检查管身完整性与密封性，确保无破损、无漏液，避免液氮渗入或污染，推荐使用经过验证的质量可靠的品牌。
冻存液：非特别要求时建议不用无蛋白、无血清等类型，常规配比的冻存液即可满足需求；若自行配制，需选用细胞培养级DMSO，避免DMSO导致的细胞死亡；非必要不选用无DMSO的冻存液。
冻存方式：非必要不采用直接放入-80℃冰箱的冻存方法，优先使用程序降温盒或程序降温仪进行程序降温，该方式更稳定可靠，能有效减少细胞损伤。
冻存体积：科研场景下，冻存讲究慢冻速溶，因此建议2.5ml冻存管按500μl/管冻存，该体积便于复苏时快速融化；最多尽量不超过1ml，避免体积过大导致复苏时融化缓慢损伤细胞。此体积在复苏时可满足1个T25培养瓶的接种量。
冻存密度：科研场景下，冻存密度一般比传代密度稍高。例如一个T25培养瓶细胞常规按1:5传代，冻存时一个长满的T25培养瓶细胞可冻存3-4支；复苏时每支可直接接种到一个T25培养瓶中，若需精确计算细胞数，可按此比例进行核算。
加冻存液顺序：离心后吸弃上清，需通过轻轻拨动离心管底部先将细胞充分分散，再加入冻存液混匀，避免细胞团聚影响冻存效果。
细胞状态：对数生长期是教科书上对不传代时细胞增殖过程的描述，MSC连续传代细胞一般不进入平台期。所以，使用适合传代的细胞进行冻存是合适的，传代时部分细胞拿去冻存是常用操作。细胞密度参考（MSC传代时机：一张图了解MSC“长满”状态）。
长期存储：经程序降温至-80℃后，不宜长时间存放-80℃，需及时移入液氮罐中长期保存，防止细胞活性下降；尽管有些冻存液宣称可以长时间-80℃存储，但不建议普通细胞培养时进行挑战。
