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组学研究服务--转录组、蛋白组

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弗元生物为更好地服务合作伙伴,能更有效、快速、精确探索研究方向,特推出“组学”相关研究服务。

其中,蛋白质组学技术主要有Lable Free、iTRAQ、SWATH;转录组主要有转录组高通量测序、mRNA芯片、lncRNA芯片、miRNA芯片、circRNA芯片。


弗元生物在组学研究的基础上,将结合我们的干细胞、分子、免疫等技术平台,为项目后期深入研究提供有力支持,力争在生物医学研究领域协助合作伙伴找到自己的准确定位,打造一个稳固的发展基础。


SWATH

SWATH(Sequential Window Acquisition of all THeoretical Mass Spectra)是瑞士苏黎世联邦理工学院的Ruedi Aebersold 博士及其团队与AB-SCIEX联合推出的一项全新的质谱技术。SWATH采集模式是一种新型的MS/MS 扫描技术,将扫描范围划分为以25 Dalton 为间隔的一系列区间,通过超高速扫描来获得扫描范围内全部离子的所有碎片信息,是 MS/MS ALL技术的扩展。SWATH技术是一种真正全景式的、高通量的质谱技术,同时也大大提高了定量的可重现性。

SwissPRO拥有强大的Triple-TOF 5600+质谱系统,使SWATH定量具有较高的准确度和动态范围,可检测到蛋白质的丰度差异极大,跨越4个数量级。且SWATH方法的灵敏度和动态范围与SRM分析水平相当。



技术原理:

SWATH技术是一种新型的MS/MS 扫描技术,以蛋白质组学样品分析中常见的扫描范围 400 ~1200 为例,每 25Dalton 作为一个扫描间隔 SWATH,每个 SWATH 扫描时间设定为 100ms,那么该扫描范围累计需要 32 个 SWATH(1200-400/25=32),完成一次扫描仅需要 3.2 秒。


与传统的 shot-gun 技术相比,SWATH采集模式能够将扫描区间内所有的肽段母离子经过超高速扫描并进行二级碎裂,从而获得完整的肽段信息。因此,SWATH技术是一种真正全景式的、高通量的质谱技术,同时也解决了 shot-gun 鉴定较低重复度的缺点。此外,借助先进的 Triple-TOF5600 plus 质谱系统,SWATH 在定量上具有较高的准确度和动态范围。与传统的基于质谱定量方法不同,基于 SWATH 技术的定量方法直接构建二级碎片离子的 XIC,大大增加了定量的准确度和可重现性。

技术特点:

1、灵敏度高:SWATH技术继承了MRM的数据采集模式,结合高分辨率的AB sciex Triple TOF+,具有与MRM相当的灵敏度;

2、可重现性高:重复样品间的定量相关性可达到0.99以上;

3、定量准确度高:定量准确度几乎与MRM技术相当;

4、线性动态范围广:定量范围可跨越4个数量级;

5、通量大:一次实验可检测到2000种以上蛋白并定量。


iTRAQ

同位素标记相对和绝对定量

同位素标记相对和绝对定量(iTRAQ) 蛋白质组学技术
      Isobaric Tags for Relative andAbsolute Quantization (iTRAQ) proteome technology

同位素标记相对和绝对定量iTRAQ(Isobaric tags for Relative andAbsolute Quantitation)技术是由美国应用生物系统公司(Applied BiosystemsIncorporation,ABI)开发的一种多肽体外标记技术。该技术采用了4种( iTRAQ® reagents – 4plex)或8种( iTRAQ®reagents – 8plex )同位素标签,通过标记肽段(Peptide)特异氨基酸位点,然后进行串联质谱分析,可灵活比较最多8种不同样本中蛋白质的相对含量和绝对含量。


技术原理:

iTRAQ实验中,经过蛋白质提取获得组织细胞中的全蛋白,全蛋白在胰酶作用下被酶解

iTRAQ实验中,经过蛋白质提取获得组织细胞中的全蛋白,全蛋白在胰酶作用下被酶解(Trypsin Digestion)成肽段,iTRAQ试剂对所获得的全部肽段进行标记。iTRAQ试剂主要由3部分组成:报告基团(Reportgroup)、平衡基团(Balancegroup)和肽反应基团(Amine-specificreactive group)。以4标试剂为例:报告基团相对分子质量分别为114、115、116和117;平衡基团相对分子质量分别为31、30、29和28,肽反应基团将iTRAQ试剂与肽段上赖氨酸(Lysine,K)及N端氨基酸残基相连,在其上4种报告基团通过平衡基团与反应基团相连,这样就形成了4种相对分子质量均为145的等量异位标签。

 



iTRAQ试剂在标记肽段样本后,报告基团和平衡基团的平衡分子量都为145,因此改变任一iTRAQ试剂,不同同位素标记的同一多肽在第一级质谱检测中分子量都完全相同。而在串联质谱(MSMS)中,同重元素标记肽段的报告基团、平衡基团和肽反应基团之间的连接键断裂,平衡基团中性丢失,同时不同同位素标签的同一肽段产生不同的质荷比(114-117)的峰。因此,根据波峰的高度和面积,可获得样品间相同肽段的定量信息,再经过软件处理得到肽段和蛋白质的定量信息。



技术特点:

1.较双向电泳(2D Electrophoresis)优势

iTRAQ技术不仅可以发现到更多的胞浆蛋白、膜蛋白、核蛋白和胞外蛋白,同时还可以检测到2D技术较难发现的低丰度蛋白、疏水性蛋白、等电点极酸和极碱蛋白、分子量极低极高蛋白(小于10kDa或大于200KDa)。


2. 分析时间快、实验误差小

可在一次实验中同时完成最多8组样本的比较,不仅减少了实验误差和缩短了实验周期,而且增加了实验统计的相关性。


3. 分析范围广

iTRAQ试剂几乎可以与样本中所有的蛋白结合,同时因为是体外标记,所以对各种动植物组织、微生物、血液、体液、细胞培养物以及分泌物等样本均可进行分析。


4. 可信度高

现代串联质谱具备扫描速度快、精度高等特点,使其二级碎片离子信号增强,产生质量更高的二级质谱,确保鉴定结果高的可信度。同时,标记试剂的报告离子的相对分子质量较低(均不超过121),低分子量区是质谱定性和定量较为准确的区域,因此检测结果更为灵敏可靠。


5. 翻译后修饰分析

保留了肽段转录后修饰的状态,因此可对磷酸化蛋白等翻译后修饰蛋白进行定性和定量研究。



Label Free

非标记定量

非标记定量(Label free) 蛋白质组学技术

Label-free quantitativeproteomics(Labelfree)technology

定量蛋白质组学是蛋白质组研究的重要内容,通过对基因表达产物——蛋白质的定量分析,以了解基因在不同的生理、病理和逆境条件下的表达情况。近年来,随着非凝胶技术的发展,“鸟枪法”蛋白质组学(“Shotgun”proteomics)技术,特别是多维蛋白质鉴定(Multidimensional Protein Identification,MudPIT)已成为研究复杂生物样本中大规模蛋白质表达和定性和定量分析的强有力工具。


在非标记策略的定量模型中,主要涉及两种不同的算法:其一,以肽段的色谱峰积分面积为基础,通过比较一对生物样品中相对应到蛋白质酶解多肽的色谱积分面积而得到两者的相对丰度;其二,以肽段被质谱检测的计数为基础,通过归一化来表征被检测蛋白质的相对丰度。非标记技术认为肽段在质谱中被捕获检测的频率(Counts)与其在混合物中的丰度成正相关,因此蛋白质被质谱检测的计数反映了蛋白质的丰度,通过适当的数学公式可以将质谱检测计数与蛋白质的量联系起来,从而对蛋白质进行定量。


技术原理:

在非标记定量策略的两种算法中,基于肽段被检测到次数的算法得到的肽段定量较色谱峰面积的算法有好的重现性(Reproducible)和动态范围(Dynamic range),但是后期需要较为复杂的算法(Alignment)和均一化方法(Normalization method)。基于现代高灵敏度质谱(High resolution of modern spectrometers)结果的分析软件Maxquant综合了以上两种定量方法的优点:以一级质谱(MS1,肽段水平)为基础,将质谱数据转化成以色谱保留时间(Retention time)和质荷比(m/z)为变量的二维图谱(图1a),在该二维图谱基础加上MS1肽段的强度(Intensity)变量,即最原始的质谱数据最终被转换成形象的三维图谱(图1b)。


技术特点

1.对质谱仪器设备要求较高,色谱和质谱需要同时有较好的稳定性和重复性。

2.需要有特殊的定量分析软件。

3.对样品中蛋白质总量要求较低,实验周期短,实验费用低。

4.不需要额外并且昂贵的标记试剂,排除了标记过程带入实验误差的风险,同时也不必考虑标记效率的问题。


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