间充质干细胞成骨诱导实验是对间充质干细胞成骨分化能力的验证，间充质干细胞的状态和活性是成骨诱导成败的关键。所以，在实验启动前要对细胞的状态进行初步判断，包括细胞表面标志、细胞纯度、细胞分化情况、细胞老化情况等，特别要注意细胞的老化。
1. 表面标志物检测：细胞的表面标志物检测可以参照2006 年国际细胞治疗协会（ISCT）的标准。我们常规的操作是检测10个标志物，将常用的标志物均包括在内。包括阴性指标CD11b、CD31、CD34、CD45、HLA-DR和阳性指标CD29、CD73、CD90、CD105、CD166。特别要注意CD105的阳性情况。2. 细胞纯度判断：间充质干细胞是典型的间质类细胞，呈梭形，容易混入上皮类细胞导致纯度不足。判定方法可以用消化法。间充质干细胞在胰酶消化液中极容易脱壁，0.125%的胰酶消化液1分钟即可使其脱壁，而上皮类细胞在这个时间内是不容易脱壁的。3. 细胞分化情况判断：间充质干细胞培养过程中细胞分化常见的为纤维化。纤维化的细胞贴壁后呈较长的纤维状，且细胞排列多出现未完全融合时的纤维叠层生长，细胞漩涡状的整体形态不明显，偶尔可见悬浮的纤维结构。分化细胞见下图。4. 细胞老化判断：细胞老化的典型特征是增殖速度变慢，倍增时间在48小时以上。显微镜下观察，除了具有普通细胞老化细胞膨胀变大、细胞内颗粒物增多、细胞内泡状结构增多等特征以外，细胞从梭形、细胞边界明显、遮光性强变为细胞扁平、边界模糊、触角增多、遮光性差。老化细胞见下图。细胞老化可以使用β-半乳糖苷酶染色确定，能染色的就是已经老化的。
1. 诱导培养基：诱导培养基请按照使用说明书使用。关于培养基中的结晶，该诱导培养基含有较多量的钙，出现结晶属于正常现象。完全培养基配制可以提前几个小时进行，可以使得各组分充分混匀和溶解。在培养基加入到细胞时确保时混合均匀的，即使在加入后能看到晶体样结晶也不影响诱导效果，间充质干细胞若具有正常的成骨分化能力，在诱导十天左右即不能再观察到结晶的存在。2. 诱导过程中的细节变化：细胞诱导开始时并未完全汇合，加入诱导液培养后，一到两天的时间内细胞会快速增殖，并完全汇合。诱导5-10天开始会看到颗粒状沉淀，沉淀大小如细菌，容易与污染混淆。随着诱导继续，沉淀会越来越多，在诱导的15-20天内沉淀聚集凝结在一起形成“钙结节”。此时，“钙结节”有明显的遮光，根据遮光的情况决定是否终止诱导进行染色。特别注意，当有颗粒或絮状沉淀时，换液一定要轻柔，尽量避免换液时导致钙沉积流失，导致诱导效果不佳。特别提示，不同组织来源的间充质干细胞和不同状态的间充质干细胞诱导出现钙沉积的时间和数量差异巨大，据了解有些脐带间充质干细胞出现钙沉积的时间大约1个月，有些脐带间充质干细胞甚至不能诱导出钙结节，这与细胞状态关系密切。
1. 染色问题：染色严格按照说明书进行。在固定之前操作要轻柔，避免细胞成片脱落导致实验无法继续。固定后相对不易脱壁，但也尽量避免较大的液流冲击。染色要求染色液过饱和，如果沉淀过多，请适当多加染色液。染色后拍照颜色可能会有色差，可以用PS对颜色进行调整。2. 培养板使用问题：如同时进行不同来源细胞的成骨诱导或者其他诱导实验，由于这些细胞诱导终止的时间可能存在差异，建议使用多个的细胞板进行实验，尽量不要安排在一块细胞板上，具体操作请根据具体情况实施。3. 换液问题：培养过程中换液需要轻柔，切不可使得细胞暴露在空气中太久，可适当留一些旧的培养基在培养孔内，以避免细胞受到干扰和钙沉积变少。4. 培养基本条件：细胞培养必须佩戴口罩、帽子、手套。头发、口鼻等是常见的细胞支原体污染源，培养室内头发等不能暴露在外。5. 特别提示：不可与成脂诱导在同一块培养板上进行，因为成脂和成骨结束的时间可能不同，固定过程会严重影响正在培养的细胞，导致细胞状态下降、死亡或污染。
