人间充质干细胞成骨诱导试剂盒

人间充质干细胞成骨诱导试剂盒

仅用于科学研究

产品信息

产品名称：人间充质干细胞成骨诱导试剂盒

货号：FY200006

批号：见包装

存储与有效期：

组分A、C、D于2-8 ℃避光保存，组分B于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的完全培养基于2-8 ℃保存，有效期1个月。

适用细胞：

人骨髓间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞，其他组织来源的人间充质干细胞。

产品介绍

间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。

为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定，弗元生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒，在稳定性、易用性上大幅改进，采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途，首先，用于鉴定人MSC是否具有成骨分化能力，满足MSC质量控制的要求。其次，在再生医学和组织工程研究中，诱导培养基也可作为除支架以外的培养培养体系。另外，诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、钙沉积量检测、免疫组化检测等。

本产品仅适用于科学研究。

操作方法

实验准备

u 试剂配制：

室温融化添加物B液，将融化的溶液加入基础培养基A液中，充分混匀。

注意：混合成诱导完全培养基后必须充分混匀，2-8 ℃保存。整个过程须确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。

u 培养皿处理：

加适量包被溶液C液到培养器皿中，轻轻摇动使其覆盖整个培养器皿底面，室温静置30-60分钟。弃去溶液 ，室温晾干。

注意：包被液C使用前必须进行室温复温。建议使用六孔板，每孔加C液1 ml，使用其他培养器皿时需考虑实验结果的稳定性。整个过程需在超净工作台中操作，避免污染。

u 自备试剂：

l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）

l  磷酸盐缓冲液（DPBS）

l  MSC完全培养基

l  4%中性多聚甲醛溶液

注意：若MSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间。

操作步骤

1.      准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，并用MSC完全培养基重悬。

2.      按照2×10⁴ cells/cm²的密度将细胞接种于已包被处理的六孔板中，每孔MSC完全培养基2 ml，37℃、5%CO₂培养箱中培养。

注意：细胞密度为该试剂盒的标准密度，可根据实验室情况进行调整，调整依据参照所检测MSC正常传代的密度接种，过夜培养后添加诱导培养完全培养基；或接种密度低，待细胞生长至下一步要求的密度后进行诱导。

3.      当细胞融合达60%时，弃去培养上清，每孔添加MSC成骨诱导完全培养基2 ml/孔，37℃、5%CO₂培养箱中培养。

注意：成骨诱导后细胞易脱壁，换液时完全培养基必须经室温复温30分钟。添加培养基时动作要轻柔，沿培养器皿侧壁缓缓加入，切记避免吹起细胞。

4.      每3天更换新鲜的MSC成骨诱导完全培养基，持续培养2-4周。

注意：细胞状态良好一般5天后培养液出现浑浊，不可与污染混淆，换液时尽量轻柔；7-10天左右出现钙沉积。一般2周内出现较大的较厚的钙沉积，透光性变差。有些细胞钙沉积出现较晚，一般不超过3周，超过3周未出现明显沉积，请注意分析操作步骤与其他原因。可根据具体实验需求选择终止时间，但不易超过4周。具体时间请根据自己实验室细胞等条件自行确定。

5.      诱导培养结束时，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/孔室温固定细胞20分钟。

注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自行确定。

6.      弃去固定液，DPBS洗2次，加入茜素红染液1 ml/孔染色15分钟。

7.      弃去茜素红染液，DPBS洗3次，添加新鲜DPBS。

注意：染色后肉眼可见孔内明显染红。染色过程中一定要避免组织细胞被风干，风干会影响显微观察效果。

8.      显微镜下观察并拍照。

注意：拍照一般选用高倍镜，请根据需要确认选择。

9.      结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见红色着色点，此处为钙结节，说明实验所用的MSC具有成骨能力。否则，所使用的MSC无成骨能力。