人间充质干细胞成软骨诱导试剂盒

仅用于科学研究

产品信息

产品名称：人间充质干细胞成软骨诱导试剂盒

货号：FY200008

批号：见包装

存储与有效期：

组分A、E于2-8 ℃避光保存，组分B、C、D于-20 ℃避光保存。所有组分均须避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的预混液于2-8 ℃保存，有效期1个月，完全培养基现配现用，2-8 ℃保存不超过72 小时。

适用细胞：

人骨髓间充质干细胞、人脂肪间充质干细胞、人脐带间充质干细胞、人羊膜间充质干细胞、人牙髓间充质干细胞、人脐带血间充质干细胞，其他组织来源的人间充质干细胞。

产品介绍

间充质干细胞（MSC）具有多向分化的潜能，体外在一定条件下可以诱导分化为脂肪细胞、成骨细胞、成软骨细胞。2006年国际细胞治疗协会（ISCT）确定此三项检测指标是MSC鉴定的必检项目，目前以MSC为基础的研究报道均会对该三个指标进行鉴定。在多种组织来源和制作方法的MSC药品质量控制中，成骨、成脂、成软骨也是必检指标。

为满足科研和制药对MSC分化能力的鉴定，弗元生物结合多年MSC研究经验优化MSC诱导试剂盒，在稳定性、易用性上大幅改进，采用了独创的小包装。该试剂盒的设计用途，首先，用于鉴定人MSC是否具有成骨分化能力，满足MSC质量控制的要求。其次，在再生医学和组织工程研究中，诱导培养基也可作为除支架以外的培养培养体系。另外，诱导培养基还可用于研究诱导分化过程中的其他检测，如mRNA检测、lncRNA检测、microRNA检测、蛋白表达检测、胶原含量检测、免疫组化检测等。

本产品仅适用于科学研究。

操作方法

实验准备

u 试剂配制：

预混液：室温融化添加物B和添加物C，将融化后加入A液，充分混匀，配制成软骨分化培养基预混液。

注意：添加物解冻后旋涡混匀、1000 g短时离心以使溶液集中于管底。将管内溶液加入A液后，吸取A液洗涤溶液瓶两次，将洗涤液加入A液中。预混液必须充分混匀，2-8 ℃保存。

诱导完全培养基：取10 ml预混液置于15 ml离心管中，加入一支添加物D，充分混匀制成诱导完全培养基，此液现配现用。1 ml预混液需加入添加物D的量为10 μl。

注意：诱导完全培养基现配现用，2-8 ℃放置不得超过72小时。整个过程须确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。

u 自备试剂：

l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他 ）

l  磷酸盐缓冲液（DPBS）

l  MSC完全培养基

l  4%中性多聚甲醛溶液

注意：若MSC完全培养基不含血清，则需要准备胰酶抑制剂。MSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间。

操作步骤

1.      准备所需诱导分化的MSC，当细胞融合达85%左右时，用消化液消化细胞，细胞沉淀用成软骨诱导预混液重悬。

2.      220 g离心5 分钟，沉淀以预混液重悬，细胞密度约2×10⁶ cells/ml，再次离心，弃上清。

3.      沉淀以成软骨诱导完全培养基重新悬浮，调整细胞密度为2×10⁶ cells/ml。

4.      分别取500 μl细胞悬液接种于15 ml离心管中，220 g离心5 分钟。

注意：每管细胞的总数在5×10⁵至1×10⁶之间，一般以1个T25细胞培养瓶接种一个软骨球为佳，细胞数过少形成的软骨团块较小，细胞数过多则可能会分开成块。正常情况下可形成1-2 mm³的团块。离心以细胞聚团为准，可适当调整。离心力过大，软骨球不易悬浮，离心力过小则可能形成软骨球效果不佳。

5.      旋松离心管盖，将离心管轻轻竖直置于37 ℃、5% CO₂培养箱中静置培养。

注意：24 小时内避免摇动细胞沉淀，以确保形成个团块。离心管需使用聚丙烯材质无菌管。

6.      诱导培养24 小时后，轻轻拨动离心管底，使细胞沉淀团块悬浮，重新放回培养箱继续培养。

注意：细胞团块重新悬浮的时间因细胞而定，基本在24-48 小时之间，以细胞团周围有聚拢现象时为准。若细胞团块贴壁较牢固，可用移液器轻轻吹动使其悬浮，注意不要吹散团块。

7.      每2天更换新鲜完全诱导培养基。换液时轻轻吸去旧培养基，每管加新鲜配制的成软骨分化完全培养基500 μl。

注意：换液时动作轻柔，以免吸出细胞团块；诱导完全培养基必须经过复温，否则影响诱导效果。在诱导培养2-3周后会出现大量细胞外基质，富含软骨蛋白多糖和Ⅱ型胶原。

8.      诱导培养14-20天，弃去培养上清，DPBS洗细胞两次，4%中性多聚甲醛溶液2 ml/管室温固定细胞1小时。

注意：培养结束时或中途可以选择其他检测方法，如基因表达检测等，若采用自己拟定的检测方法则后续方案需要自己拟定。一般软骨球诱导致密后能进行染色处理，时间在14-20天左右，时间过久可能导致团块内部出现空泡，甚至团块裂开，具体时间请以自己细胞的特性自行确定。

9.      弃去固定液，DPBS洗2次，脱水、石蜡包埋后切片。

注意：脱水包埋可以用擦镜纸包裹后使用自动脱水机脱水、包埋，也可以在原离心管中逐级更换脱水、透蜡的液体，手工包埋。过程中一定注意团块不要丢失。

10.  阿利新蓝染色：将切片进行脱腊和复水，阿利新蓝染液染色30 分钟，流水冲洗5 分钟，脱水、透明、中性树胶封片，显微镜下观察、拍照。

注意：染色和制片过程中避免干片，干片后会导致组织形态发生变化，影响观察、拍照效果。根据需要可以选择苏木素复染，不建议复染。

11.  结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则，所使用的MSC无成软骨能力。

注意：该鉴定方法和判定标准为定性实验标准，可根据具体情况设置其他判定方法和标准。以上提供的是包埋切片染色的方案，若实验室条件限制，可选择直接对团块进行染色，方法见B9、B10、B11。若试剂盒用于组织工程软骨诱导，可作为除支架材料以外的诱导液使用。

B9.  弃去固定液，DPBS洗团块2次。

注意：切片染色对实验室条件和病理研究技术有一定的要求，但结果展示较为美观，适合对美观要求较高的使用。为降低试剂盒使用难度、降低时间成本，我们准备了结果判断的备选方案，该方案操作相对简单，对实验室要求较低，耗时较少，也可适当缩短诱导周期。

B9.  阿利新蓝染色：向团块中加500 μl阿利新蓝染液染色30 分钟。弃染色液，加纯水5 ml摇动清洗5分钟/次，反复洗5次。

注意：染色液中的团块不易看清，务必小心吸去上清，避免样本丢失。样本始终需要保持在液体中，避免失水导致形态改变。

注意：染色时间请根据实际情况确定，时间控制在10-30分钟，时间太久颜色过深，可能不易分辨。

注意：使用直接进行诱导球进行染色时诱导周期可以适当缩短，一般情况下15天即可有蓝色着色，时间越久蓝色着色相对越深。具体诱导周期根据实验室的具体情况进行调整。

B10.            结果判定：按照程序操作完毕，低倍镜下观察可见深蓝色着色，肉眼观察也可见蓝色着色，该蓝色染色的为酸性粘多糖，说明实验所用的MSC具有成软骨能力。否则，所使用的MSC无成软骨能力。

注意：结果拍照最好使用反射光拍照设备，用透射光的显微镜会导致结果呈深蓝色或黑色。可以使用体式镜、相机或手机相机进行拍摄，结果相对美观。相机或手机相机拍摄时，将清洗过的蓝色小球（诱导球）置于较为宽阔的培养皿，培养皿内装足量的纯水，保持水面平整，且没过小球3-5毫米。皿下置放平整的白纸，避免使用镜面做背景，可使用直尺置于下方进行大小的参照。尽量避免用强光照射，可以用散射光进行打光。可以在小球的正上方拍摄，也可以稍微倾斜进行拍摄，避免液面反光。