产品信息

产品名称：人脐带间充质干细胞无血清培养基

货号：RC200136

批号：见包装

试剂清单：

存储与有效期：

组分A于2-8℃保存，组分B于-20℃保存。所有组分均须避免反复冻融及复温，各组分在所需要的温度下有效期为1年，配制完成的完全培养基于2-8℃保存，稳定储存2-3周。

适用细胞：

适用于人脐带间充质干细胞的原代分离、扩增与传代培养。

产品介绍

人脐带间充质干细胞培养基是一款化学成分明确的新一代培养基，专门为人脐带间充质干细胞（hUMSC）培养设计，能够支持人脐带间充质干细胞生长、扩增，无需培养表面包被就能让细胞较好地贴壁，可有效延缓细胞在体外培养时的老化。可用于人脐带充质干细胞的原代分离、扩增与传代培养，并保持人脐带间充质干细胞的多种生物学特性及多向分化潜能，培养的人脐带间充质干细胞具有成骨、成脂、成软骨的分化能力，正常人脐带间充质干细胞表达CD73、CD90、CD105、CD166，不表达CD11b、CD31、CD34、CD45和HLA-DR。人脐带间充质干细胞在此培养基条件下可稳定传代约20代，但不具有无限传代能力。

操作方法

实验准备

u 人脐带间充质干细胞完全培养基配制：

1.      添加剂处理：室温解冻人脐带间充质干细胞培养基添加剂（RC200136-B）。添加剂融化后轻轻充分摇匀，分装或直接按比例添加到基础培养基中，分装后添加剂立即存储于-20℃至-80℃，避免反复冻融。

注意：添加剂解冻不可加热，建议采用室温溶解。

2.      完全培养基配制：将添加剂以10%比例加入到人脐带间充质干细胞基础培养基（RC200136-A）中，充分混匀，即配制成人脐带间充质干细胞完全培养基（RC200136）。完全培养基在2-8℃可稳定储存2-3周，超过3周的完全培养基请谨慎使用。

注意：混合成人脐带间充质干细胞培养基后必须充分混匀，2-8℃保存。整个过程确保无菌操作，各试剂开封前以75%酒精擦拭表面。完全培养基使用前务必室温复温至少30分钟，该操作适用于下列所有用到完全培养基的步骤。

u 自备试剂：

l  消化液（0.25%Trypsin-0.04%EDTA或其他）

l  无钙镁的磷酸盐缓冲液（DPBS）

l  细胞冻存液

操作方法（仅供参考，请根据各自实验需求自行制定操作规程）

u 原代细胞培养（酶消化法）：

1.       该部分以单细胞悬液为操作起始。使用胰酶、胶原酶、分散酶等酶消化法（推荐使用组织细胞消化液RC200104）从人脐带华通氏胶组织获得。

2.       原代接种：以上获得的细胞沉淀，漩涡震荡使其分散为单个细胞，加入适量的完全培养基，充分混匀。200 g离心5-10分钟。弃去上清，漩涡震荡使沉淀分散为单个细胞，加入适量的完全培养基，充分混匀。按照一定的细胞密度接种与培养器皿中。37℃、5%CO₂、饱和湿度静置培养48小时。该时间段内请勿移动培养器皿，也无需观察。48小时后观察细胞，根据情况选择半量或全量更换新鲜完全培养基。

注意：细胞培养务必选择合适的贴壁细胞培养器皿，若培养器皿不合适则严重影响细胞的贴壁、增殖甚至存活。

3.       换液培养：后每48小时更换新鲜培养基。观察细胞，弃去原培养上清。若悬浮细胞较多，则可用DPBS轻轻洗涤细胞1-2次。添加新鲜完全培养基继续培养。

4.       传代：原代细胞传代以克隆大小和克隆中心细胞密度为标准。若克隆中心细胞密度较大，则不论整个培养器皿是否长满均应进行传代操作。弃去培养上清，加入适量的DPBS，轻轻晃动后弃去DPBS，重复洗涤2-3次。加入适量的0.25%胰蛋白酶消化液（推荐使用间充质干细胞消化液，RC200108）室温消化2分钟，加入5倍体积的完全培养基终止消化。用移液管、吸管或移液枪头等轻轻吹打细胞，使细胞从培养皿表面脱落、分散。将细胞悬液移入离心管中，水平离心机200 g离心5分钟。弃去上清，漩涡震荡分散细胞，加入适量的完全培养基，再次漩涡震荡均匀悬浮细胞。按照1:3-1:6的比例接种到新的培养器皿中，继续培养。后续传代间隔为3-5天。

注意：足量的胰酶消化，室温消化不宜超过2分钟，吹打细胞时也不宜力量过大，轻轻吹打即可，不脱落细胞直接丢弃。

5.       冻存：参照下述“hUMSC细胞冻存”。

u 原代细胞培养（组织块法）：

1.       该部分以组织块作为起始。组织块为脐带华通氏胶切成1-3 mm³大小的组织块。

2.       原代接种：用缓冲液清洗过的组织块，用适量的完全培养基悬浮，300目无菌滤网过滤或200 g离心5-10分钟，收集组织块。用适量的完全培养基重新悬浮组织块，均匀接种于培养器皿中，37℃、5%CO₂、饱和湿度静置培养。48小时内最好不要对培养器皿进行任何移动。

3.       换液：48小时后进行半量或全量更换新鲜完全培养基，具体视情况而定。每2天更换新鲜培养液。组织块周围有密度较高的细胞时，可以选择去除组织块。

4.       传代：参照上述“传代”方法。

5.       冻存：参照下述“hUMSC细胞冻存”。

u hUMSC细胞传代培养（非原代）：

1.       在显微镜下观察细胞，当细胞融合度达到90%，即可传代。

2.       弃去培养上清，加入DPBS溶液清洗1次，加入细胞消化液（推荐使用间充质干细胞消化液，RC200108）使其完全覆盖培养器皿底部。

3.       室温孵育1-2分钟，轻轻拍打培养器皿，显微镜下观察大部分细胞从培养器皿底部脱落后立即停止消化。

4.       加入消化液2倍体积的人间充质干细胞完全培养基，用移液器轻轻吹打培养器皿表面未完全脱离的细胞，使细胞完全脱落并均匀分散。

5.       将细胞悬液转移到离心管中，200 g离心5分钟。

6.       弃上清，加入完全培养基，重悬细胞，计数。1：3-1：6比例传代，均匀铺在培养器皿中，置于37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养。

u hUMSC细胞复苏：

1.       从液氮中取出冻存的hUMSC细胞，迅速将冻存管/冻存袋放入复苏装置或37℃水浴快速融化。

2.       将解冻后的细胞悬液缓慢加入适量完全培养基（冻存体积与培养基的体积比为1：5-1：10）。

3.       200 g离心5分钟，弃去上清，加入适量的完全培养基重悬细胞。

4.       将细胞均匀铺到培养器皿中，摇动培养器皿使细胞均匀分布，37℃、5%CO₂、饱和湿度培养，24小时后观察细胞状态。

5.       24小时后更换新鲜完全培养基继续培养，以后每2天更换新鲜完全培养基。

注意：细胞传代所需的时间：2-4天。hUMSC消化极易过度，建议稀释0.25%胰酶消化液一倍，且严格控制消化时间，消化时长从细胞接触胰酶开始不宜超过2分钟。

u hUMSC细胞冻存

1.       细胞达到90%汇合度，弃去原有培养基，DPBS清洗1次。

2.       加入细胞消化液（推荐使用间充质干细胞消化液，RC200108）使其完全覆盖培养器皿底部，室温孵育1-2分钟，轻轻拍动培养器皿，显微镜下观察大部分细胞从培养器皿底部脱落后立即停止消化。

3.       加入消化液2倍体积的人间充质干细胞完全培养基，用移液器轻轻吹打培养器皿地面未完全脱离的细胞，使细胞完全脱落并均匀分散。

4.       将细胞悬液转移到离心管中，200 g离心5分钟，弃去上清。

5.       加入适量细胞冻存液（推荐使用细胞冻存液Ⅱ，RC200106），调整细胞冻存密度在1×10⁶ cells/cm₂左右，每支冻存管分装0.5-1 ml，使用冻存袋冻存请自行根据需要选择冻存方案。

6.       程序降温仪冻存，或放入冻存盒然后置于-80℃或直接放入-80℃，24小时后转入液氮中长期保存。

注意：此处消化液为胰酶消化液。细胞冻存方法有多种，此处介绍的冻存方法为含有DMSO的冻存方式。其他冻存方式请根据需要自行选择。

特别提示：以上所有操作均在无菌细胞培养室进行，细胞开放操作要在生物安全柜内进行；培养器皿包括培养皿、培养瓶、培养板、细胞工厂等，请根据实验需要自行选择；hUMSC切忌消化过度，过度的消化会导致细胞快速老化，且失去部分或全部分化能力；实验室具体可操作的传代次数请自行分析判断，并建议以分化能力进行判别；该培养基仅用于hUMSC细胞培养，操作规程仅作为参考。

细胞形态展示：