本产品基于Hoechst 33342和碘化丙啶（PI）双染的方法以区分活细胞和死细胞。细胞核荧光染料Hoechst 33342可以穿透细胞膜，嵌入双链 DNA，可激发出蓝色荧光。对于活细胞和死细胞，Hoechst 33342均能进入细胞内使DNA所在部位在紫外激发下呈蓝色。PI也是一种双链DNA染料，嵌入双链DNA中可以激发出红色荧光。但PI不能穿透细胞膜完整的正常细胞或凋亡细胞早期细胞，即活细胞不能被PI染色。而对于死细胞，其细胞膜的完整性已丧失，可被 PI 染色。

综上所述，经上述两种染料双染后，使用荧光显微镜检测时，活细胞仅可激发出蓝色荧光，死细胞则可激发出红色荧光＋蓝色荧光。

本试剂盒染色快速方便使用荧光显微镜检测时，无需稀释等配制过程，也无需再准备其他任何溶液。本试剂盒足够检测100个样品，每个样品的细胞数量可达10⁵-10⁶个。

本产品可用于培养的贴壁细胞或者悬浮细胞检测。

自备耗材和设备：

1 ml 移液器

100-200 μl 移液器

荧光显微镜

PBS

适用实验与操作过程：

1. 细胞准备

贴壁细胞：弃细胞培养液，加入0.5 ml细胞培养液或PBS。

悬浮细胞：收集细胞悬液，1000 g离心5分钟，弃上清。沉淀用0.5 ml的0.5 ml细胞培养液或PBS。

2. 染色

Hoechst 33342/PI染色工作液配置：0.5 ml PBS中加入5 μl Hoechst33342染液（A液）和5 μl PI染液（B液），混匀待用。

贴壁细胞：每个细胞样品加入0.5 ml配置好的Hoechst33342/PI染色工作液。冰浴或 4℃，避光孵育20-30分钟。

悬浮细胞：每个细胞样品加入0.5 ml配置好的Hoechst33342/PI染色工作液。冰浴或 4℃，避光孵育20-30分钟。

注意：染色结束后尽快进行后续荧光检测，每个检测细胞数不超过1×10⁶个。

3. 检测与分析

荧光显微镜观察：

贴壁细胞：检测前弃去染色液，PBS洗涤一次，加入PBS保持细胞活性，然后在荧光显微镜下观察。

悬浮细胞：4℃ 1000 g离心 3-5分钟，沉淀细胞，用 PBS 洗涤一次。用PBS重新悬浮细胞，置于培养板中观察红色和蓝色荧光

Hoechst 33342与 DNA 结合后其最大激发波长为 352 nm，发射波长为 400-500 nm（最大激发波长 461 nm），即在紫外光激发下产生蓝色荧光；PI与 DNA 结合后可用激发波长 488 nm （最大激发波长 535 nm），发射波长大于 575 nm（最大激发波长 617 nm），即在黄色激光激发下产生红色荧光。

文献引用

赵鹏. 人VEGF基因修饰脂肪源间充质干细胞的成骨特性研究[D].南华大学,2020.

常见问题：

1. 是否需要防护？

Hoechst 33342、PI具有毒性，操作时应注意防护，保护眼睛、避免吸入、并戴一次性手套。

2. 是否需要避光？

Hoechst 33342、PI存在淬灭现象，保存和使用过程中注意避光，建议染色后需尽快检测。

3. 单个反应的细胞数量是否有要求？

推荐细胞数量10⁵-10⁶个之间。原则上只要求染色液的量与细胞量匹配，即细胞量多时可根据具体情况按比例增加染色液的量，细胞量少时按比例减少染色液的量。一般染色液过量短时间内不影响染色效果，但染色液不足时会导致检测数据不准确。

4. 细胞染色时间有何要求？

Hoechst 33342与细胞孵育时间不宜过长，一般控制在20分钟以内。太长容易引起该染料的发射光谱由蓝光向红光迁移，导致红色荧光和蓝色荧光比例改变。时间过长也会导致细胞状态与真实状态不一致，可能导致检测数据不准确。

5. 能否用于流式检测？

可以尝试进行流式检测。贴壁细胞不建议用于流式检测，因为贴壁细胞脱壁处理会影响细胞状态或者破坏细胞膜，导致PI染色细胞数量偏多，从而偏离真实。悬浮细胞可以进行流式检测，操作尽量在短时间内完成。

6. 能否检测凋亡细胞？

原则上该试剂盒只能检测细胞膜通透性的差异，即非通透性的细胞膜只允许Hoechst 33342进入，通透性的细胞膜同时也允许PI进入。Hoechst 33342在活性较好的细胞中也可被细胞主动排出细胞外，所以亮度相对低，但仅是相对关系，难以绝对说明问题。所以不建议用Hoechst 33342的染色亮度分辨细胞凋亡。

与描述相符