编号	名称	1000T	2000T
A	RealFAST ProbePCR mix	1.3 ml×4	1.3 ml×8
B	Primer & Probepremix	0.5 ml×2	0.5 ml×4
C	Lo-ROX（50×）	0.2 ml×1	0.4 ml×1
D	ddH₂O	1 ml×3	1 ml×6

产品简介：

本产品是基于Taqman MGB探针法开发的SNP分型试剂盒。该试剂盒具有灵敏度高、区分度高、可重复性高、抗干扰性强等特点。试剂盒包含RealFAST Probe PCR mix 、Lo-ROX、Primer & Probe premix 、ddH₂O等SNP分型所需的所有试剂，无需另外准备配套试剂，具有操作简便、分析简单、结果可靠等优点。

自备耗材和设备：

移液器2 μl，10 μl，100 - 200 μl；

冰盒；

荧光定量PCR管；

实时荧光定量PCR仪。

反应设置与操作过程：

1. 探针分型：

FAM标记A型；VIC标记G型。

2. 反应体系：

PCR反应体系（10 μl）：
名称				体积（μl）
RealFAST Probe PCR mix				5
Primer & Probe premix				1
Lo-ROX（50×）				按机器品牌与型号添加
DNA				1（10 - 40 ng）
ddH₂O				补足至10 μl
仪器型号对Lo-ROX添加的要求：
仪器		终浓度
ABI PRISM 7000 /7300 /7700 /7900HT /Step One		5×(即：Lo-ROX 1μl /10μl体系)
ABI 7500 /7500 Fast； Stratagene Mx3000P /Mx3005P /Mx4000		1×(即：Lo-ROX 0.2μl /10μl体系)
Roche仪器； Bio-Rad仪器； Eppendorf仪器		无需添加
反应条件：
项目	温度		时间		循环数
预变性	95 ℃		5 min		1
变性	95 ℃		10 sec		40
退火/延伸	60 ℃		30 sec*

注：*处进行荧光信号采集。

3. 操作过程：

3.1 试剂准备：试剂盒从-20℃冰箱取出，室温融化；涡旋仪混匀，瞬时离心待用。

3.2 用量计算：根据需要检测的样本数n，配置n+4个反应体系混合液。即5×(n+1)μl RealFAST Probe PCR mix、(n+1)μl Primer&Probe premix （rs231775）、0.2×(n+1)μl Lo-ROX（50×）、2.8×(n+1)μl ddH₂O。（若反应数较大，可适当多增加几个反应。）

3.3 反应混合液配制：将上述计算的用量按次序用移液器加入同一新鲜干净的EP管中，涡旋仪混匀，瞬时离心。（若反应数较大，可选用较大EP管。请务必旋窝充分混匀！）

3.4 添加反应混合液：按照每孔9μl的量将配置好的反应体系分装至八联排（或96孔板）。

3.5 添加模版：将1μl已经定量并稀释至10-40 ng/μl 的DNA模板加入分装的反应体系中。

3.6 添加质控：三种质控质粒中各取1 μl分别加入到反应体系中，构成三个阳性质控（可选）；加入1 μl ddH₂O与另一反应体系中，构成阴性质控。

3.7 瞬时离心：八联排（或96孔板）盖上管盖（或封膜），瞬时离心，使DNA模板与反应体系混合并处于管底。（请务必进行瞬时离心，否则可能出现无扩增的结果！）

3.8 上机：将八联排（或96孔板）放入ABI7500PCR仪，根据反应条件设置ABI 7500软件，开机运行。（请根据选用的机型进行相关设置。）

3.9 特别说明：配置体系过程中，需要戴一次性乳胶手套（或PE手套）；避免接触管盖（或封膜），防止污染，导致荧光信号不准确。阳性质控质粒拷贝数极高，应严格规范操作，防止交叉污染。

注：操作请在冰盒上进行。

常见问题：

1. 存储条件与反复冻融如何选择？

该产品-20 ℃条件下可以存储6个月；2-8 ℃可以存储1周。组分A、B、C均不能反复冻融，融化后不建议再次冻存。

2. 反应体系的确认？

该试剂盒建议反应体系10 μl。若必须使用其他反应体系，需自行验证后在进行大量样本的检测。

3. 反应条件是否可以改动？

本试剂盒的反应条件根据多种参数确定，并适用于10 μl反应体系，为确保实验数据的准确性，不建议改动。

4. 机器设备的适用与选择？

该试剂盒适用于多种实时荧光定量PCR仪，但注意Lo-ROX的添加有所不同，需严格按照试剂盒和机器说明书进行。

5. 出现无扩增？

该实验为精细实验，对操作要求较高。请按照说明书操作，尤其是加样、加样后的离心等。为提高实验成功率，可选择加倍反应体系，例如使用20 μl体系进行初步学习，实验条件可不变。

6. 如何避免未扩增的样本出现假分型结果？

不同引物的扩增背景荧光强度不同，分析结果需要判断是背景还是扩增产物荧光。因样本质量或加样失败均会导致扩增失败，此时背景荧光容易被误判为扩增信号，导致判读基因型错误。为避免此情况发生，在数据判读前，应先辨别所有样本及阴阳性对照（若有）扩增曲线是否正常；若出现无扩增或扩增曲线异常的样本，应先剔除，然后分析其他样本的基因分型结果，此样本查明情况后重新检测。

7. 扩增曲线荧光信号弱，或扩增曲线呈锯齿状？

此问题可能有多种原因造成，常见原因及解决办法见下表。

原因	解决办法
检测光谱设定误差	不同荧光定量PCR仪的检测光谱范围有差异，根据所用仪器型号设置检测的荧光信号范围。
荧光采集时间太短	扩增曲线锯齿状较明显时，将延伸时间设定为45 - 60 秒可得到改善。
目标DNA的拷贝数过少	目标DNA拷贝数只有几倍到几十倍时，容易形成线性混乱，提高样品浓度再进行反应。
样本浓度过低或严重降解	更换高浓度样本或质量更好样本进行实验。