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TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)

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FY600017-20TTUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)20 TEST15601092
FY600017-50TTUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)50 TEST27301911


弗元生物,TUNEL试剂盒1折试用

试用产品:FY600017-20T

活动时间:2019年5月7日--2019年7月31日

数量有限,售完为止。


产品简介:

        细胞在发生凋亡时,细胞内激活的DNA内切酶会切断核小体间的基因组DNA,DNA会被降解成为约180 bp-200 bp 的片段,而正常或增殖细胞很少发生DNA断裂。脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT 酶)把FITC标记的dUTP标记到断裂DNA片段的3’-OH 末端,从而使DNA片段标记上绿色荧光。然后进行荧光显微镜或流式细胞仪检测,这个方法被称为TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法细胞凋亡检测。

        本产品能够在DNA碎片末端标记上千bp的核苷酸,因而具有极高的灵敏性。可检测的样本类型有:石蜡包埋组织切片,冰冻切片,贴壁细胞和悬浮细胞。检测方法可以使用荧光显微镜或者流式细胞仪。


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TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(FITC)

 


 

产品编号:

FY600017-20T

FY600017-50T

存储条件:

-20 ℃避光保存,有效期12个月或更久;

若频繁使用可在4℃避光保存3个月。

避免反复冻融。

产品组分:

编号

名称

20T

50T

A

rTdT

20 μl

50 μl

B

标记混合物

1000 μl

2500 μl

 

产品简介:

细胞在发生凋亡时,细胞内激活的DNA内切酶会切断核小体间的基因组DNADNA会被降解成为约180 bp-200 bp 的片段,而正常或增殖细胞很少发生DNA断裂。脱氧核糖核苷酸末端转移酶(TdT 酶)把FITC标记的dUTP标记到断裂DNA片段的3’-OH 末端,从而使DNA片段标记上绿色荧光。然后进行荧光显微镜或流式细胞仪检测,这个方法被称为TUNEL(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling)法细胞凋亡检测。

本产品能够在DNA碎片末端标记上千bp的核苷酸,因而具有极高的灵敏性。可检测的样本类型有:石蜡包埋组织切片,冰冻切片,贴壁细胞和悬浮细胞。检测方法可以使用荧光显微镜或者流式细胞仪。

 

 

自备耗材和设备:

1 ml 移液器

200 μl 移液器

20 μl 移液器

15 ml离心管

流式细胞仪

荧光显微镜

PBS

PIDAPI染色液(选做)

蛋白酶K(选做)

适用实验与操作过程:

1.        样本处理:

1.1         悬浮细胞(细胞悬液)

a)      收集细胞,PBS洗涤一次。

b)      1%甲醛的PBS或者4%多聚甲醛室温固定30分钟。摇床轻轻晃动防止细胞成团。

c)      PBS再洗涤1次。

d)      0.2% Triton X-100PBS重悬细胞,室温孵育5分钟。

1.2         贴壁细胞(细胞爬片/涂片)

a)      PBS洗涤细胞1次。

b)      1%甲醛的PBS4%多聚甲醛室温固定30分钟。

c)      PBS洗涤1次。

d)      用含0.2% Triton X-100PBS室温孵育5分钟。

1.3         冰冻切片

a)      4%多聚甲醛室温固定60分钟。

b)      PBS洗涤2次,每次5分钟。

c)      0.5% Triton X-100PBS,室温孵育5分钟。或者用20 μg/ml的蛋白酶K室温作用15-30分钟(若用蛋白酶K通透处理,后续需用PBS洗涤2-3次,每次5分钟,将蛋白酶K漂洗干净)。

1.4         石蜡切片

a)      脱蜡:二甲苯脱蜡2-3次,每次5-10分钟。

b)      复水:用无水乙醇,90%乙醇,70%乙醇,蒸馏水依次浸泡,每次2-5分钟。

c)      滴加20 μg/ml 蛋白酶K室温处理15-30分钟。

d)      PBS洗涤2-3次,每次5分钟,将蛋白酶K漂洗干净。

2.        配制TUNEL反应体系:


1个样本

N个样本

标记混合物

50   μl

50×N   μl

rTdT

1   μl

1×N   μl

总体积

51   μl

51×N   μl

3.        流式细胞仪检测悬浮细胞或者细胞悬液:

a)      PBS洗涤细胞1-2次,每次5分钟。细胞沉淀中加入TUNEL反应液50 μl37℃避光反应60分钟。

b)      PBS洗涤2-3次,每次5分钟。

c)      选作:加PI或者DAPI染色液1 μl /ml,染细胞核。

d)      补加500 μl PBS,流式细胞仪检测。

4.        荧光显微镜检测细胞涂片或者细胞爬片或者组织切片:

a)      PBS洗涤1-2次,每次5分钟。

b)      加入TUNEL反应液50 μl37℃避光反应60分钟。

c)      PBS洗涤3次,每次5分钟。

d)      选作:加PI或者DAPI染色液1 μl /ml,染细胞核。

e)      荧光显微镜下观测并拍照。


 

注意事项与常见问题:

 1. 单个反应的细胞数量是多少?

流式细胞仪检测推荐细胞总数为3-5 × 106。对于细胞爬片或者涂片,推荐60-90%汇合度。对于常规组织的冰冻切片或者石蜡切片,推荐切片厚度为2-5 μm,避免切片太厚。

2. 是否需要避光?

荧光物质均易发生淬灭,在进行荧光观察时,尽量缩短观察时间,同时在操作和存放过程中也尽量注意避光保存。

3. 细胞离心条件?

对于悬浮细胞或者细胞悬液,洗涤时候离心条件推荐为300 g5分钟。

4. 细胞固定条件?

细胞样品固定可以用1%甲醛的PBS溶液或者4%的中性多聚甲醛。组织切片样品推荐用4%的多聚甲醛。

5. 细胞通透处理条件选择?

细胞样品通透推荐用0.2%Triton X-100或者70%的预冷乙醇-20℃通透1-4小时。细胞样品可以在70%的乙醇溶液中-20℃保存1周。冰冻切片样品通透可以选择0.5% Triton X-100或者20 μg/ml的蛋白酶K。石蜡切片样本推荐用20 μg/ml的蛋白酶K进行通透处理。蛋白酶K做通透处理的时候,需要摸索通透时间,时间太短造成通透不彻底,时间太长容易脱片。。

6. 使用时需及时清洗流式细胞仪。

PI流式上机时具有一定的粘性,请及时清洗流式细胞仪,避免堵塞。连续上机数量过多也可能导致仪器堵塞导致数据误差,可在检测到一定数量的样本时进行次氯酸清洗,然后进行剩余样本的检测。


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